植物瞬時表達系統(tǒng)的建立與應用

植物瞬時表達系統(tǒng)的建立與應用

0植物基因功能及基因外源基因表達系統(tǒng)的應用和完善隨著大量序貫的完成，植物基因功能的研究進入了更深、更廣泛的階段。目前,對植物基因功能的研究主要通過轉基因、基因敲除、基因沉默等方法。如:王力娜等克隆分析了與棉花開花有關的MADS-box基因家族,并利用轉基因技術對其中2個基因進行了功能驗證;李蓓等利用轉基因技術獲得了轉TsVP的抗旱玉米,雖然分析F1代有抗旱性,但由于獲得純系玉米的實驗周期比較長,不易在短期內驗證基因功能;此外植物中的基因敲除、基因沉默主要通過隨機插入突變引起基因失活,但有時會引起染色體重排,以致突變體表型與隨機插入無關,而且對插入位點的確定、遺傳學分析都比較困難。因此通過轉基因和基因沉默技術驗證基因功能,存在實驗周期長,費時費力,且結果不一定理想等問題;此外,一些植物外源基因轉化體系不易建立,也影響了利用轉基因的方法檢測、驗證基因功能。因此在利用上述經典方式研究基因功能的同時,有必要建立一些快速驗證基因表達、檢測蛋白質互作、短期內能高效表達外源蛋白質的新方法。瞬時表達是指引入細胞的外源DNA和宿主細胞染色體DNA并不發(fā)生整合,而是隨載體進入細胞后12h左右就可表達,基因產物在2~4天內即可被檢測出。由于瞬時表達能表達多種外源基因,而且時間短,重復性好,彌補了常規(guī)轉基因方式中周期長,轉化效率低等一些缺點。因此,不同物種的瞬時表達體系也逐漸被建立。目前,植物瞬時表達系統(tǒng)已被陸續(xù)應用到生物學的許多研究中,尤其是利用該系統(tǒng)進行基因功能的鑒定分析、發(fā)現(xiàn)新型強啟動子、蛋白質互作、亞細胞定位等方面;此外,該系統(tǒng)也可表達外源基因生產重組蛋白,為疫苗、抗體、生物制藥的研發(fā)開辟了捷徑。本研究就植物瞬時表達系統(tǒng)的起源,建立方法,應用等方面進行了概述,同時也針對該系統(tǒng)在應用中存在的不足提出了相應的建議。1植物基因突變基因瞬時表達系統(tǒng)起源于20世紀六七十年代,稱為第一代瞬時表達系統(tǒng)。此時的瞬時表達技術主要應用于離體細胞、原核細胞中蛋白質的瞬時表達。Hoerz等利用蛋白質的瞬時表達分析了網織紅細胞多核糖體中初始蛋白質的合成;Kryzek等研究了大腸桿菌argECBH基因簇在瞬時表達中的調控機制;隨著生物學研究的不斷深入,有關瞬時表達的應用也加快了步伐,如Klein等用基因槍成功地將外源DNA轉入完整的洋蔥表皮細胞,在2~4天內表達了外源基因;第二代瞬時表達系統(tǒng)的研究以原生質細胞為受體,如Fromm等采用電穿孔技術,將pNosCAT和pCaMCATV質粒轉入玉米原生質體,得到瞬間表達。但第二代瞬時表達系統(tǒng)轉化頻率低,一般為10-6~10-2,且操作前需要準備大量的原生質體。第三代瞬時表達系統(tǒng)主要在植物活體中進行相關的研究,不同物種的瞬時表達體系也逐漸被建立。如柳枝稽瞬時表達系統(tǒng)、優(yōu)化的煙草瞬時表達系統(tǒng)、草莓瞬時表達系統(tǒng)、萵苣瞬時表達系統(tǒng)、還有油菜籽、洋蔥、黃瓜等植物的瞬時表達系統(tǒng)也被研發(fā)并應用。利用瞬時表達體系有助于研究本物種的相關基因及蛋白功能,Li利用擬南芥瞬時表達系統(tǒng)研究了d35s啟動子活性、擬南芥中3個基因(At3g51660、At1g01170、At2g47840)的亞細胞定位及蛋白互作等相關問題;同時該系統(tǒng)也可表達外源基因生產重組蛋白,為疫苗、抗體、生物制藥的研發(fā)開辟捷徑,如Raffaele在煙草中瞬時表達了HIV-1的輔助蛋白Nef,為HIV疫苗的研發(fā)奠定了基礎;Jussi在煙草瞬時表達體系中高效表達了來源于里氏木霉的疏水蛋白質基因。尤其在最近十幾年內,隨著瞬時表達與免疫組化、激光共聚焦掃描顯微鏡技術的結合,利用該系統(tǒng)進行相關基因、蛋白質方面的研究也越來越多,并開始向環(huán)境檢測、病毒防治、微生物利用、細胞骨架等方面擴展,標志著瞬時表達體系在不斷完善的同時也將進入更先進的一代。2基于植物的立即表達系統(tǒng)的設計方法植物中建立瞬時表達系統(tǒng)的方式有:PEG法、電激法、基因槍法、浸泡和摩擦接種法、病毒感染法和農桿菌介導法。2.1原生質體的制備困難該方法介導原生質體轉化,是最早建立植物細胞瞬間表達的技術,但是轉化率低、需要處理大量的原生質體且原生質體的培養(yǎng)較困難,也無法對組織、器官等特異性基因進行研究而逐漸被淘汰。2.2植物基因組織通過動力系統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒(DNA吸附在表面)以一定的速度射進植物細胞,由于顆粒小穿透力強,故不需去除細胞壁就可進入植物組織細胞。其優(yōu)點:無宿主限制,靶受體類型廣,具有潛在分生能力的組織細胞幾乎都可以;操作簡單、快速。缺點:轉化率低;基因的整合位點不固定,易造成外源基因丟失,而不利于表達;此外,基因槍的費用較高。2.3泡沫和摩擦繁殖法將實驗材料浸泡在外源基因的翻譯產物RNA中或將其涂抹噴灑在材料表面。該方法對實驗人員和實驗環(huán)境的要求比較高,而且方式繁瑣、不易操作。2.4外源基因檢測以重組病毒作為載體感染植物細胞建立瞬間表達系統(tǒng),其轉化方式如下圖1所示。其特點:不產生可遺傳的后代,降低了基因漂移和病毒大規(guī)模感染的風險;載體穩(wěn)定,表達水平高;操作簡便。近年來利用病毒攜帶外源基因轉入植物已有較成熟的技術,如豇豆花葉病毒CPMV、煙草花葉病毒TMV、普通花葉病毒PVX,TEV、TMV和PVY也是目前常用的病毒載體,此外個別TMV、PVX可以侵染單雙子葉植物,擴大了寄主范圍。但用此種方法,需將病毒本身的一些致病基因刪除,以免導致植物感染病毒,引起植物病變或基因組發(fā)生變異,而不利于外源基因的表達。2.5常用載體和使用的菌株將攜帶外源基因的農桿菌利用真空滲透或直接注射到組織細胞中,利用質粒T-DNA區(qū)的轉移進行轉染,是研究植物轉基因的常用方法之一,也是目前建立瞬時表達系統(tǒng)的優(yōu)先選擇。其流程如下圖2所示。目前常用載體有pBIl2l、pMOG800等,常用農桿菌有LBA4404、EHAl05、Gv3101、AGLl等。農桿菌介導法操作簡便,易于轉染,但轉染的宿主有限,常被用來轉染雙子葉植物,單子葉中的應用相對較少。而且一些外源基因可在農桿菌中表達造成假陽性,為避免該現(xiàn)象可構建攜帶內含子的質粒作為載體,如p2301質粒、Pcambia1301質粒等。由于內含子在真核生物mRNA成熟過程中可被精確地切除,而原核細胞不具有剪切內含子的功能,從而可避免由于農桿菌中遺漏表達造成的假陽性。3高通量基因和蛋白質的應用植物瞬時表達系統(tǒng)方便、簡捷,可快速達到高通量篩選、鑒定基因和蛋白質的要求,可應用于研究啟動子活性、基因功能、生產外源蛋白、亞細胞定位以及蛋白質組學等方面。3.1快速探索植物啟動子的轉錄表達植物基因的啟動子包含多種重要的順式作用元件,這些元件和轉錄因子相互作用在轉錄水平上控制基因表達的起始時間和表達程度,進而調控下游相應基因的表達。將啟動子序列與報告基因(Gus、GFP、Luciferase等)融合構建表達載體后轉入植物細胞,通過報告基因的瞬時表達,短時間內即可確定啟動子活性以及活性的強弱,如謝迎秋通過將棉花曲葉病毒(CLCuV)啟動子在煙草和棉花中建立瞬時表達發(fā)現(xiàn),該啟動子是一種新型雙向強啟動子,可應用于雙子葉植物尤其棉花的遺傳轉化中;Koia等通過該系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)菠蘿的轉錄因子SUI1和L36啟動子能夠驅動Gus在擬南芥中的表達;該系統(tǒng)也可快速確定同一啟動子在不同植物中或同一植物中不同部位的作用,李昊通過Gus基因的瞬時表達,快速分析了毛白楊LEAFY同源基因PtLFY啟動子在煙草不同部位的表達活性;Toshiki則利用瞬時表達系統(tǒng)研究了紅藻紫屬中啟動子在配子體和孢子體不同的轉錄調控機制;唐杏嬌等通過瞬時表達分析菊花葉片中CmDFR啟動子片段發(fā)現(xiàn),除了含有TATA-box、CAAT-box等基本的元件外,還含有與MYB轉錄因子相結合的元件。上述研究表明瞬時表達系統(tǒng)可應用于植物中啟動子、增強子等轉錄元件的功能分析,發(fā)掘有用的強啟動子,加快植物啟動子的研究進程;同時了解啟動子對轉錄調控機制的影響,以應用于基因工程中提高或改進外源基因的表達。3.2基因表達系統(tǒng)基因組測序的發(fā)展使大量基因的克隆和定位不斷完成,但對它們的表達行為、產物性質及定位的認識并不清楚,基因與表型的對應關系以及基因的功能分析則成為迫在眉睫的問題。瞬時表達系統(tǒng)可在短時間內操縱組織細胞中相關基因的表達與沉默,加快基因的研究。竺曉平等利用馬鈴薯X病毒CP基因的瞬時表達在轉化植物前快速地檢測了轉基因的表達情況以及表達產物的功能,節(jié)約時間和資源,也減少實驗的盲目性;Pudota等通過馬鈴薯瞬時表達系統(tǒng)分析了大量晚期抗枯萎病基因RB,快速鑒定了各種RB基因的功能,加速了對馬鈴薯基因功能的研究。樹木的生長周期一般較長,利用轉基因技術對其基因結構功能的分析較少,但瞬時表達系統(tǒng)的建立為其研究開辟了一條捷徑。雷蓉華通過APX基因(表達抗壞血酸過氧化物酶)在蘋果葉片中建立了瞬時表達體系,優(yōu)化了蘋果的遺傳轉化體系;Zhang等通過樺樹瞬時表達系統(tǒng)分析了肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因的過量表達和基因沉默,為下一步的研究奠定基礎;近年來,瞬時表達系統(tǒng)在白楊樹、楤木、柳樹、桑樹以及一些草本植物中也得到成功應用。瞬時表達系統(tǒng)還具有高通量篩選鑒定基因和蛋白的功能,快捷靈敏地檢測、解析基因的剪接加工機制,如Craig等用此系統(tǒng)構建了含5個基因的融合載體,并對其功能進行了逐步的探索;高少培等利用煙草瞬時表達系統(tǒng),對水稻BADH2和擬南芥GR7基因片段的轉錄后剪接加工機制進行了研究,并發(fā)現(xiàn)一些重要的剪接調控元件。3.3實時時域作用對植物抵抗tmv的影響RNA是生物體和生物細胞完成遺傳和表達不可或缺的物質,利用瞬時表達系統(tǒng)與RNA干擾、RNA沉默技術相結合對RNA進行相關研究,高效識別不同種類RNA的功能特點,增加產物的多樣性。如Cao等利用基因的瞬時表達鑒定了家蠶中調控蠶絲蛋白L鏈中41個保守的miRNA并確定了其中4個miRNA的功能特點;趙明敏也利用該技術研究了同源于TMV外殼蛋白的siRNA對TMV侵染的干擾機理,為植物抵抗TMV的感染提供理論基礎;Pavan等利用雙鏈RNA干擾煙草天蛾自身基因的表達,從而使CYP6B46,CYP4M1和CYP4M3基因在其體內得到瞬間表達,進而分析了CYPs類基因的功能。瞬時表達技術的運用還有助于了解vsiRNAs的組成、調控基因表達的潛力,以及病毒中RNA沉默抑制子(RSSs)的作用機制,為植物抵抗病毒的感染提供新策略。郝興安等運用農桿菌介導的瞬時表達系統(tǒng)對黃瓜壞死病毒(CNV)p20蛋白的功能進行了系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)CNVp20在瞬時表達中不能有效抑制RNA沉默;景秀麗利用植物中建立的瞬時表達系統(tǒng)分析鑒定了6種禽類病毒對RNA沉默抑制的功能,并初步明確了HVT063和NS1的沉默抑制特點及作用機理。3.4重組蛋白及重組基因的活性作為一種安全、高效快速的外源蛋白生產體系——植物瞬時表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展的一種新型蛋白表達方式。該系統(tǒng)不需要經歷植物組織培養(yǎng)即可在短時間內、以低廉的成本獲得多種外源蛋白,且外源蛋白產量高、易于純化,為藥用蛋白的表達,各種疫苗的研發(fā)提供一條捷徑,也使植物成為快速高效表達外源基因的一個工廠。目前已有多種抗體、生長因子、激素、重組酶及多種疫苗分別在煙草、豆類、玉米、番茄、香蕉及萵苣等植物中成功表達。Noemi等將人乳頭瘤病毒16L2型與馬鈴薯X病毒融合后,瞬時表達驗證了植物是生產肽抗原的良好場所,為生產各種疫苗提供了實際經驗;楊鳳萍利用病毒載體在煙草中的瞬時表達,快速評估了外源基因HBsAg重組蛋白的免疫活性;劉月英等用馬鈴薯病毒X(pGR107)做載體在煙草中瞬時高效表達了人表皮生長因子(hEGF),表達量達總可溶性蛋白0.0103%,并具有良好的生物活性。表1為利用瞬時表達系統(tǒng)表達外源蛋白的部分實例。3.5進行亞細胞定位亞細胞中分布著參與細胞新陳代謝的多種蛋白質和酶,已有證據表明,亞細胞中的蛋白質亞組,經常共同作用行使一定的功能。因此了解亞細胞定位是全面理解細胞整體功能的重要環(huán)節(jié)。利用瞬時表達系統(tǒng)可在短時間內進行快速高效的亞細胞定位,如李超利用豌豆花瓣中建立的瞬時表達系統(tǒng),分析了由于CYCLOIDEA(CYC)類TCP蛋白亞細胞定位的不同,導致TCP基因在豆科與玄參科植物中具有不同的功能;Zhang等運用該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了水稻葉綠體中參與光合作用的一些酶;而朱丹等則利用煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證了可用于植物亞細胞定位的載體卡盒pCEG。3.6免疫熒光技術蛋白質是基因的產物,其功能是生物性狀的直接體現(xiàn)。蛋白質、酶通常相互作用在信號轉導和調控中扮演著重要的作用。植物細胞瞬時表達系統(tǒng)結合熒光蛋白融合技術或免疫熒光技術可用于蛋白質水平的研究,快速檢測蛋白質在細胞中的分布,驗證蛋白互用,揭示配體與受體的識別機理等。早在1987年Ballas等就利用質粒的瞬間表達檢測了氯霉素乙酰轉移酶(CAT)的活性;植物瞬時表達系統(tǒng)也逐漸應用于特異性蛋白的表達、互作機制等方面的研究,曹友志利用楊樹瞬時表達體系從25個候選效應因子中篩選出4個重要的效應因子。這都充分表明植物瞬時表達系統(tǒng)可用于酶活性的測定、效應因子的篩選、蛋白調控等方面,加快蛋白質組學的研究步伐。4勞動時間和基因表達系統(tǒng)綜上所述,植物瞬時表達系統(tǒng)為快速的表達外源蛋白提供了一個理想的工作平臺,尤其對生產口服疫苗或藥用蛋白。一方面縮短了實驗周期、降低了實驗成本;另一方面植物作為生物反應器安全、外源蛋白質產量高、易于純化等目前已得到了廣泛的應用。但瞬時表達系統(tǒng)也存在一些問題:(1)由于不產生可穩(wěn)