基于酶法體外轉(zhuǎn)化的防風類成分升麻素的研究

基于酶法體外轉(zhuǎn)化的防風類成分升麻素的研究

傳統(tǒng)中醫(yī)防風是傘狀植物科的多年生針刺植物海防（turcz.）schichk干燥的根。其性溫,味甘辛,歸膀胱、肝、脾經(jīng),具有解表祛風、勝濕、止痙等功效。防風是我國重要的傳統(tǒng)中藥之一,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,已有幾千年的藥用歷史。近年來國內(nèi)外文獻對防風的藥理作用報道較多,防風提取物及某些成分具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤、抗過敏、抗凝血等多種作用。研究表明色原酮類成分為其主要活性成分之一,且該類化合物中的升麻素苷在防風中含量較高,中國藥典2010年版(一部)中,就以升麻素苷的含量作為評價防風質(zhì)量的指標。但近來藥理學研究發(fā)現(xiàn):人腸內(nèi)菌可將升麻素苷轉(zhuǎn)化為升麻素(升麻素苷的苷元);升麻素為吸收良好的化合物,升麻素苷為吸收中等的化合物;升麻素才是防風的主要入血成分,而升麻素苷的入血量極微。上述多種藥理學報道充分說明了升麻素才是防風在體內(nèi)的主要代謝形式。因此,本文對酶法轉(zhuǎn)化防風中含量較高的升麻素苷成升麻素的工藝進行了研究,酶解過程見圖1,并通過HPLC探索最佳的酶解制備升麻素的條件,為應用復合酶制備生產(chǎn)升麻素提供依據(jù)。1藥物、試劑和儀器防風(RadixSaposhnikoviae)購買于北京同仁堂藥業(yè)有限公司,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院鄭毅男教授鑒定;植物精提復合酶SPE-007(夏盛實業(yè)集團有限公司);升麻素苷、升麻素(純度>98.5%,批號111522、111710,中國食品藥品檢定研究院);甲醇(色譜純,美國Tedia公司);甲醇、乙醇、冰醋酸等化學試劑(分析純,北京化工廠);純凈水(娃哈哈集團有限公司)。島津LC-2010高效液相色譜儀(日本島津公司);JHBE-50S閃式提取器(河南金鼐科技有限公司);超聲波清洗器KQ-250DB(昆山市超生儀器有限公司);SHA-CA水浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。2測試方法2.1植物精提復合酶活性的測定根據(jù)植物精提復合酶的生物學特性,進行預實驗得出其反應最優(yōu)pH為4.8。后精密量取pH為4.8的醋酸溶液10mL,置于40℃恒溫水浴中預熱后,加入定量的植物精提復合酶,40℃活化10min,再按所需比例加入定量的升麻素苷,最后在設定的溫度下振蕩一定時間。2.2乙醇溶液色譜稱取藥材防風1kg,加入9L50%的乙醇閃提,抽濾,重復3次,合并提取液,減壓濃縮得浸膏137g。取浸膏50g,使用AB-8大孔吸附樹脂色譜柱,分別用30%、50%、70%和90%的乙醇水溶液進行梯度洗脫,減壓濃縮,得各梯度組分。取30%乙醇組分2g,使用ODS色譜柱進行柱色譜純化,以30%甲醇洗脫,減壓濃縮洗脫液,得升麻素苷粗品600mg。2.3單因素酶分解實驗2.3.1酶解母液配制取pH為4.8的醋酸溶液7份各10mL,分別加入6、7、8、9、10、11、12mg的植物精提復合酶SPE-007,配制成濃度為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2mg·mL-1的酶解母液,40℃活化10min。再稱取7份上述分離到的升麻素苷各20mg,分別加入到活化后的母液中,在50℃水浴中振蕩反應48h。反應結束后取出樣品,對酶進行高溫滅活,真空干燥,干粉用甲醇定容至100mL,0.45μm濾膜過濾后供HPLC分析。2.3.2酶解母液活化取6份pH為4.8的醋酸溶液各10mL,各加入等量的植物精提復合酶SPE-007,配制成最佳酶濃度(由上述酶濃度單因素實驗證明得到)的酶解母液6份,40℃活化10min。再稱取6份各20mg的升麻素苷分別加入到活化后的母液中,在溫度分別為35、40、45、50、55、60℃的水浴中振蕩反應48h。反應結束后取出樣品,對酶進行高溫滅活,真空干燥,干粉用甲醇定容至100mL,0.45μm濾膜過濾后供HPLC分析。2.3.3酶解母液的活化取6份pH為4.8的醋酸溶液各10mL,各加入等量的植物精提復合酶配制成最佳酶濃度(由酶濃度單因素實驗證明得到)的酶解母液6份,40℃活化10min。再稱取6份各20mg的升麻素苷分別加入到活化后的母液中,在最佳溫度(由上述酶解溫度的單因素實驗證明得到)的水浴中振蕩反應,時間分別為8、16、24、32、40、48h。反應結束后取出樣品,對酶進行高溫滅活,真空干燥,干粉用甲醇定容至100mL,0.45μm濾膜過濾后供HPLC分析。2.4采用高效液相色譜法測定了升麻素核苷酸和升麻素的含量2.4.1對照品溶液的制備精密稱定升麻素苷5mg和升麻素4mg,分別用甲醇定容于10mL量瓶和25mL量瓶中,制成0.5mg·mL-1升麻素苷對照品溶液和0.16mg·mL-1升麻素對照品溶液,再吸取升麻素苷對照品溶液100μL和升麻素對照品溶液200μL,兩者混勻即得。2.4.2供試品溶液配制精密稱定分離得到的升麻素苷粗品20mg,加甲醇定溶于100mL量瓶中作為空白供試品溶液,樣品供試品溶液的配制參照上述酶解方法中各單因素試驗。2.4.3色譜條件檢測色譜柱:HypersilODS柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇(A)-水(B),梯度洗脫(0～20min,20%→45%A;20～40min,45%→70%A);檢測波長:254nm;流速:1.0mL·min-1。在上述色譜條件下色譜圖見圖2。結果表明,升麻素苷和升麻素峰分離效果較好,且各成分理論塔板數(shù)不低于3000。2.4.4升麻素苷、升麻素的線性回歸分析精密吸取混合對照品溶液5、10、15、20、25、30μL,進樣測定,以進樣量為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸,得升麻素苷、升麻素的回歸方程分別為:Y=13.387X-14.658r=0.9992Y=4.596X-6.549r=0.9991表明升麻素苷在0.834～5.001μg、升麻素在0.534～3.201μg線性關系良好。2.4.5進樣穩(wěn)定性試驗精密吸取混合對照品溶液20μL,在上述色譜條件下進樣,連續(xù)重復6次,記錄峰面積,計算得升麻素苷和升麻素峰面積的RSD分別為0.76%和0.93%。結果表明此方法精密度良好。2.4.6進樣測定的結果按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液,分別在0、3、6、9、12、15、18、21、24h后在上述色譜條件下進樣測定,結果升麻素苷和升麻素峰面積的RSD分別為0.98%和1.0%。表明供試品溶液中的升麻素苷和升麻素在室溫條件下24h內(nèi)穩(wěn)定。2.4.7進樣穩(wěn)定性試驗按“2.4.2”項下方法分別制備6份供試品溶液,在上述色譜條件下各進樣20μL,記錄峰面積,結果供試品中升麻素苷和升麻素峰面積的RSD分別為1.1%和1.5%。重復性較好。2.4.8加樣回收率試驗各取升麻素苷粗品(測定含量為30%)和酶解后30%的升麻素6份,精密稱定,每份2mg,分別加入一定量的升麻素苷和升麻素混合對照品溶液,按“2.4.2”項下方法制備成供試溶液,依照“2.4.3”項下色譜條件進樣20μL,測定回收率。結果升麻素苷平均回收率為102.7%,RSD為1.4%;升麻素的平均回收率為102.3%,RSD為1.5%。3結果與分析3.1酶濃度對升麻素苷轉(zhuǎn)化率的影響本研究以升麻素苷的轉(zhuǎn)化率為評價指標[計算方法:(酶解前升麻素苷含量-酶解后升麻素苷含量)/酶解前升麻素苷含量],對不同酶濃度條件下的升麻素苷轉(zhuǎn)化率進行測定,結果見圖3。如圖所示,當酶濃度在0.6～1.1mg·mL-1時,升麻素苷的轉(zhuǎn)化率與酶濃度呈正相關;當酶濃度為1.1mg·mL-1以上時,升麻素苷轉(zhuǎn)化率不再隨酶濃度的增加而增大。這是因為當酶濃度低于1.1mg·mL-1時,隨著酶量的增加,越來越多的升麻素苷與酶結合反應,因此轉(zhuǎn)化率升高;而當酶濃度達到1.1mg·mL-1時,該酶達到飽和濃度,升麻素苷基本全部被酶解,因此轉(zhuǎn)化率最高,不再隨酶濃度的增加而增大。本研究同時對酶濃度為1.1mg·mL-1時酶解后反應液中升麻素的含量進行測定,結果顯示其與酶解前升麻素苷的含量基本相同,進一步說明在植物精提復合酶SPE-007濃度為1.1mg·mL-1時升麻素苷轉(zhuǎn)化相對完全,升麻素得率最大。3.2酶解溫度對升麻素苷轉(zhuǎn)化率的影響不同酶解溫度下升麻素苷的轉(zhuǎn)化率見圖4。如圖所示,當酶解溫度在40～50℃時,升麻素苷的轉(zhuǎn)化率隨溫度的增加而增大;50℃時達較大值,為95.12%;50℃以上時,轉(zhuǎn)化率隨溫度的增加反而降低。因為當溫度在50℃以下時,酶活性隨溫度增加而增強,且有利于提高酶解速率;當溫度達50℃以上時,部分酶蛋白發(fā)生變性,升麻素苷的轉(zhuǎn)化率因受之影響而降低。在本研究中為進一步提高升麻素苷的轉(zhuǎn)化率,又對酶解溫度分別為45、46、47、48、49、50℃時的升麻素苷轉(zhuǎn)化率按照“2.3.2”項下方法進行測定,結果顯示當酶解溫度為48℃時,升麻素苷的轉(zhuǎn)化率最大,為99.82%。同時對酶解溫度為48℃時,酶解后反應液中升麻素的含量與酶解前升麻素苷的含量進行比較,結果表明兩者含量基本相同,進一步說明在酶解溫度為48℃時,升麻素苷較完全地轉(zhuǎn)化為升麻素。3.3間的延長變化酶解時間對升麻素苷轉(zhuǎn)化率的影響如圖5所示:升麻素苷的轉(zhuǎn)化率在酶解時間為40h之前隨時間的延長明顯增大,而在40h以后隨時間的延長變化較小。這是由于酶解時間的延長,酶活力得到充分利用,酶解進行越完全,升麻素苷的轉(zhuǎn)化率就越大。本研究為保證升麻素苷的酶解反應進行相對完全,將酶解時間選為48h,此時升麻素苷的轉(zhuǎn)化率為99.80%。此外,本研究對當酶解溫度為48℃時,酶解后反應液中升麻素的含量與酶解前升麻素苷的含量進行比較,結果顯示兩者含量基本相同,說明此時升麻素苷經(jīng)酶解反應,基本全部轉(zhuǎn)化成升麻素。4酶法分離升麻素苷,特點穩(wěn)定性強本文通過先前實驗分離制備出了純度為30%的升麻素苷,并在梯度洗脫的色譜條件下進行檢測,旨在說明所進行的酶解反應底物僅包含升麻素苷一種主要色原酮類成分,進而對雜質(zhì)性成分進行分析,可以確定底物中不含可干擾結果的糖苷類物質(zhì),即不影響對升麻素苷轉(zhuǎn)化率的計算。從前期獲得升麻素苷來看,推測雜質(zhì)為色素等脂溶性成分,該類成分不干擾酶轉(zhuǎn)化的過程。本文首次報道了通過酶法轉(zhuǎn)化升麻素苷來制備升麻素的方法,此法簡單高效,結果穩(wěn)定可靠,為工業(yè)化生產(chǎn)制備升麻素提供了一種可行、有效的方法。由于在防風中升麻素主要以糖苷(即升麻素苷)的形式存在,升麻素苷的含量遠遠大于升麻素,在防風中含量很高,故本試驗以藥材防風為升麻素苷的來源,經(jīng)簡單的提取分離即得到了大量較高純度的升麻素苷成分。同時,酶轉(zhuǎn)化方法具有反應條件溫和、效率高、易于控制、操