發(fā)酵工程應(yīng)用實(shí)例 酶制劑生產(chǎn)

酶制劑生產(chǎn)一、酶的生產(chǎn)方法1、提取法直接從動、植物細(xì)胞或組織中將酶提取出來。提取法雖簡單易行，但受原材料來源的限制。2、化學(xué)合成法是20世紀(jì)60年代中期出現(xiàn)的新技術(shù)。只能合成那些已知化學(xué)結(jié)構(gòu)的酶；成本比較高。目前仍然停留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)合成的階段。3、微生物發(fā)酵法是20世紀(jì)50年代以來生產(chǎn)酶的主要方法。利用微生物細(xì)胞的生命活動合成所需酶的方法稱為發(fā)酵法。

酶的發(fā)酵生產(chǎn)是現(xiàn)在酶生產(chǎn)的主要方法。二、應(yīng)用微生物來開發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)微生物酶①微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全，幾乎所有的酶都能從微生物中得到②微生物繁殖快、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)簡便，并可以通過控制培養(yǎng)條件來提高酶的產(chǎn)量③微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等方法培育出新的產(chǎn)酶高的菌株三、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝條件及控制

發(fā)酵法生產(chǎn)酶制劑，就是給酶的生產(chǎn)菌種提供適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)和生長環(huán)境，使生產(chǎn)菌大量增殖，同時合成所需要的酶，然后由發(fā)酵所得物料制成酶產(chǎn)品。

現(xiàn)代酶制劑的大規(guī)模生產(chǎn)以深層液體發(fā)酵法為主。

無論哪種發(fā)酵法，都要做三方面的工作：（1）從原料準(zhǔn)備培養(yǎng)基；（2）從原始菌種準(zhǔn)備生產(chǎn)菌種；（3）發(fā)酵過程管理。（一）發(fā)酵產(chǎn)酶的一般工藝流程[原料][原始菌種][麩皮等原料]

↓↓餅粕等原料淀粉質(zhì)原料試管斜面培養(yǎng)(活化)[配制培養(yǎng)基]

↓

↓

↓(滅菌)按不同原料凈化、粉碎搖瓶等分級擴(kuò)大培養(yǎng)作不同處理↓

↓水解種子罐培養(yǎng)

↓

↓

[淀粉糖液][發(fā)酵罐(液體發(fā)酵)][發(fā)酵池(固體發(fā)酵)]

↓↓

↓

培養(yǎng)

配制培養(yǎng)基↓

(滅菌)[發(fā)酵液][成品曲]

↓↓

↓下游加工

{液態(tài)酶制劑}

↓{固體粗酶制劑}{各種精制酶制劑}酶發(fā)酵生產(chǎn)的一般工藝流程圖（二）常用的產(chǎn)酶微生物1、細(xì)菌大腸桿菌

谷氨酸脫羧酶、天冬氨酸酶、青霉素?；浮⑻於０访?、β-半乳糖苷酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、核酸外切酶等?？莶輻U菌

α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、5‘-核苷酸酶、堿性磷酸酶。2、放線菌鏈霉菌：葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素酰化酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等。3、霉菌黑曲霉：糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：氨基?；浮⒘姿岫ッ?、果膠酶等。紅曲霉：α-淀粉酶、糖化酶、麥芽糖酶、蛋白酶等。青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素?；?、纖維素酶等。木霉：纖維素酶。根霉：糖化酶、蔗糖酶、堿性蛋白酶，脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。毛霉：蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。4、酵母

啤酒酵母：丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等。

假絲酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶等。（三）生產(chǎn)種子的制備

生產(chǎn)種子：由原始保藏菌種，經(jīng)過活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。1、種子制備工藝過程保藏菌種活化培養(yǎng)逐級搖瓶培養(yǎng)種子罐培養(yǎng)接種至發(fā)酵罐（1）菌種活化

目的：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定的條件下培養(yǎng)，以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動能力。

方法：在試管斜面上培養(yǎng)1-3代。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)

目的：活化后的菌種經(jīng)過一級至數(shù)級的擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。

方法：分為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和車間培養(yǎng)兩個階段。擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)注意的事項(xiàng)：（1）盡量減少傳代次數(shù)，以降低菌種衰退和污染的可能性；（2）培養(yǎng)基成分一般應(yīng)比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富；（3）培養(yǎng)時間一般控制在微生物生長的對數(shù)生長期，及時接入下一級培養(yǎng)或發(fā)酵罐；（4）嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件（pH、溫度、通氣量等），加強(qiáng)培養(yǎng)過程的實(shí)時監(jiān)測。四、提高酶產(chǎn)量的措施（一）添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，添加酶合成的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶產(chǎn)量。1、不同的酶有各自不同的誘導(dǎo)物；但有時一種誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)生成同一酶系的若干種酶；同一種酶往往有多種誘導(dǎo)物。3、誘導(dǎo)物的濃度：必須控制在適當(dāng)濃度。2、誘導(dǎo)物的分類（1）酶作用的底物；（2）酶作用底物的類似物；（3）酶的反應(yīng)產(chǎn)物；（4）底物和底物類似物的前體物。（二）控制阻遏物的濃度1、解除終產(chǎn)物阻遏的方法降低培養(yǎng)基中酶作用產(chǎn)物的濃度；添加終產(chǎn)物的類似物。2、解除分解代謝產(chǎn)物阻遏的方法控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源濃度，可采用其他較難利用的碳源（如淀粉等），或采用補(bǔ)料，分次流加碳源等方法，以控制碳源濃度在較低的水平，以利于酶產(chǎn)量的提高；添加一定量的環(huán)腺苷酸（cAMP），可以解除分解代謝物阻遏作用。（三）通過基因突變提高酶產(chǎn)量使誘導(dǎo)型變成組成型；使阻遏型變成去阻遏型。（四）其他提高酶產(chǎn)量的方法1、添加細(xì)胞滲漏增強(qiáng)物：

如吐溫（Tween）、催通（Triton）等。

在培養(yǎng)基中添加1%的吐溫（Tween），可使纖維素酶的產(chǎn)量提高10~20倍。2、其他產(chǎn)酶促進(jìn)劑

植酸鈣：霉菌蛋白酶或橘青磷酸二酯酶1~20倍聚乙烯醇衍生物：可防止霉菌菌絲結(jié)球，提高糖化酶產(chǎn)量聚乙烯醇、醋酸鈉等：纖維素酶

這些物質(zhì)的實(shí)際效果明顯，但作用機(jī)制還需深入探討。五、酶的分離純化（一）酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。1、細(xì)胞破碎許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。1）機(jī)械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞破碎珠高壓細(xì)胞破碎機(jī)DY89-I型電動玻璃勻漿機(jī)酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇Ｒ话阏f來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。2、酶的提取

提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。

為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。（1）沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離鹽析在鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現(xiàn)象。有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。

常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等有機(jī)溶劑沉淀法（2）過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

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類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>