菠菜內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離、篩選與鑒定

菠菜內(nèi)生拮抗細(xì)菌的分離、篩選與鑒定摘要：從菠菜葉片上和菜園土壤中分離細(xì)菌，篩選出對(duì)菠菜霜霉病菌或菠菜炭疽病菌拮抗作用強(qiáng)的菌株，并挑選出生活力強(qiáng)、適應(yīng)性好、防病效果好的作為目標(biāo)菌株，并其鑒定到種。技術(shù)路線：菠菜內(nèi)生細(xì)菌的分離拮抗菌株的篩選目標(biāo)菌株的鑒定拮抗菌株的生物學(xué)測(cè)定1實(shí)驗(yàn)材料1.1樣品來(lái)源菠菜菜園內(nèi)土壤和菠菜植株。1.2供試病原菌菠菜霜霉病菌(Peronosporaeffusa)和菠菜炭疽病菌(Colletotrichumspinaciae),由本實(shí)驗(yàn)室分離和鑒定。1.3培養(yǎng)基細(xì)菌的分離用NA、KB和TSA。細(xì)菌的培養(yǎng)用NA或LB。細(xì)菌的菌種保存用NA或YPA。真菌的培養(yǎng)與拮抗測(cè)定用PDA。細(xì)菌的生理生化測(cè)定用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1.4標(biāo)準(zhǔn)菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)標(biāo)準(zhǔn)菌株。西瓜細(xì)菌性果斑病病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulliWillemsetal.1992)標(biāo)準(zhǔn)菌株Aac7500。1.5溶液與試劑草酸銨結(jié)品紫染劑，魯戈?duì)柕庖?，番紅復(fù)染劑，西薩一基爾染媒劑，苯酚品紅染劑，7.6%孔雀綠水溶液，1%漠百里酚藍(lán)水溶液，甲基紅試劑，0.3%肌酸水溶液，格里斯試劑，吲哚試劑，10%(W/V)FeCl3溶液，1%二甲基對(duì)苯撐二胺水溶液，3%(v/v)過(guò)氧化氫。2實(shí)驗(yàn)方法2.1菠菜內(nèi)生細(xì)菌的分離從菠菜的健葉和病葉上取樣，各取1.0g，先用70%酒精浸泡5min，再用0.2%升汞表面消毒2-3min，無(wú)菌水沖洗3次。取0.5ml最后1次無(wú)菌水沖洗液涂布接種于各種培養(yǎng)基上。每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)48h，觀察有無(wú)菌落產(chǎn)生。據(jù)此驗(yàn)證此消毒方法是否能全部殺死供試材料表面微生物。樣品晾十后轉(zhuǎn)入無(wú)菌研缽中研磨勻漿，加5ml無(wú)菌水碾碎，靜止15min后，各取50l涂平板，每處理重復(fù)3次，30°C黑暗培養(yǎng)48-72h，計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存，供測(cè)試鑒定。2.2菠菜病原菌拮抗菌株的篩選采用對(duì)峙生長(zhǎng)法，測(cè)定以上分離菌株對(duì)菠菜霜霉病菌或菠菜炭疽病菌的拮抗性。具體步驟：在直徑為9cm的PDA平板中央接入直徑為8mm的病原真菌菌塊，同時(shí)在平板四個(gè)邊緣距中央中心處接入一小環(huán)目標(biāo)菌株菌落(37C，NA上培養(yǎng)24h)，28C下黑暗培養(yǎng)，設(shè)不接種的為對(duì)照。3d后觀察各個(gè)菌株對(duì)病菌的拮抗效果。2.3拮抗菌株的鑒定2.3.1常規(guī)測(cè)定革蘭氏染色將細(xì)菌接種在斜面上，25C培養(yǎng)24?28h后，用結(jié)品紫草酸銨染色法進(jìn)行染色，鏡檢。鞭毛染色將細(xì)菌在斜面上培養(yǎng)18?24h后，用西薩一基爾染色法進(jìn)行染色，鏡檢。芽孢染色將菌株培養(yǎng)48?72h后，用孔雀綠藏紅染色法染色，然后鏡檢。2.3.2生理生化測(cè)定葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨2.0g，NaCl5.0g，K2HPO40.2g，葡萄糖10.0g，瓊脂6.0g，漠百里酚藍(lán)，1%水溶液3ml,蒸餾水1000.0ml，pH7.0-7.2，分裝，滅菌。穿刺接種，每株4支，其中兩支用滅菌的凡士林封蓋，約0.5—1cm，以隔絕空氣為閉管，另兩支不封為開(kāi)管，同時(shí)用不接種的閉管和開(kāi)管作對(duì)照。適溫培養(yǎng)1、2、3、7、14d觀察結(jié)果。只有開(kāi)管產(chǎn)酸變黃者為氧化型，開(kāi)管和閉管均產(chǎn)酸變黃者為發(fā)酵型。硝酸鹽還原試驗(yàn)每支試管分裝5mL含有硝酸鹽的培養(yǎng)基(KNO31.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，瓊脂3.0g，蒸餾水1000.0ml，pH7.0-7.2)，滅菌后每個(gè)菌株針刺接種4管，其中2支用3%瓊脂封管，置25C培養(yǎng)2周，若在封管的瓊脂下有氣泡產(chǎn)生，表示有脫氮的作用，未封管的試管在培養(yǎng)3、5、7d后用Griess-Liosvary試劑(試劑A：對(duì)氨基苯磺酸8.0g，5N醋酸1000.0ml；試劑B：二甲-a-奈胺6.0ml，5N醋酸1000.0ml)測(cè)定，每管加試劑A和B各1ml，如呈紅色，表示有亞硝酸根。明膠液化每支試管分裝5ml含明膠的培養(yǎng)基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，明膠120.0g，蒸餾水1000.0mL)，滅菌后穿刺接種細(xì)菌，置25C下培養(yǎng)，定期觀察明膠是否液化。淀粉水解細(xì)菌接種在淀粉培養(yǎng)基平板上(牛肉膏2.0g，蛋白胨17.5g，淀粉1.5g，瓊脂17.0g,蒸餾水1000.0mL，pH7.0)，置25°C下培養(yǎng)4小時(shí)，然后往平板上加碘液，此時(shí)培養(yǎng)基是否呈深藍(lán)色，若菌落周?chē)鸀闊o(wú)色透明圈者為陽(yáng)性。苯丙氨酸脫氨酶將細(xì)菌在斜面(培養(yǎng)基：酵母膏3g，NaCl5g，Na2HPO41g，瓊脂12g，L一苯丙氨酸1g，蒸餾水1000mL)上37C培養(yǎng)4h或8?24h測(cè)定，將試劑10%(W/V)的FeCl3溶液滴到斜面上，當(dāng)斜面上和冷凝水中產(chǎn)生綠色時(shí)為陽(yáng)性反應(yīng)，即表明已形成了苯丙氨酸，不變則為陰性。吲哚的產(chǎn)生把細(xì)菌接種于1%胰胨水溶液中適溫培養(yǎng)1、2、4、7d后，沿管壁緩慢加入3?5mm高的試劑于培養(yǎng)液表面，在液層面發(fā)生紅色，即為陽(yáng)性反應(yīng)。若顏色不明顯，可加4?5滴乙醚全培養(yǎng)液，搖動(dòng)，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮全液面后再加吲哚試劑。如培養(yǎng)液中有吲哚時(shí)，吲哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)，則顏色明顯。V-P測(cè)定將目標(biāo)菌株在NA斜面上培養(yǎng)24?48h，加入3?5ml的蒸餾水，配成菌懸液，每管加入5ul的菌懸液標(biāo)記分別培養(yǎng)2、4、6d，測(cè)試時(shí)將培養(yǎng)液體加入40%NaOH等量相混，加少許肌酸，過(guò)10min或更長(zhǎng)觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性。糖、醇類的利用芽孢桿菌培養(yǎng)基((NH4)2HPO41.0g，KCl0.2g，MgSO40.2g，酵母膏0.2g，瓊脂5.0-6.0g，糖類或醇類(D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、乳糖或D-甘露醇)10.0g蒸餾水1000ml漠百里酚藍(lán)0.04%)PH7.0-7.2分裝試管112oC滅菌30min。穿刺接種25C培養(yǎng)1、3、5d后觀察，如果變黃色說(shuō)明陽(yáng)性不變或變藍(lán)說(shuō)明陰性。接觸酶測(cè)定將24h培養(yǎng)的目標(biāo)菌株，以鉑絲接種環(huán)抹一小環(huán)于滴有3%的過(guò)氧化氫玻片上，如果有氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性，如果無(wú)氣泡為陰性。(10)檸檬酸鹽的利用將目標(biāo)菌株在NA斜面上培養(yǎng)24h?48h，加入3?5ml的蒸餾水配成菌懸液，每管加入50ul的菌懸液混合，過(guò)1、3、7d后觀察，如果由綠色變成藍(lán)色并有明顯氣泡產(chǎn)生則為陽(yáng)性反應(yīng)，無(wú)明顯變蘭色則為陰性反應(yīng)。2.4拮抗菌株的生物學(xué)功能測(cè)定2.4.1拮抗性測(cè)定采用夾層法測(cè)定拮抗菌株對(duì)菠菜霜霉病菌菌絲或菠菜炭疽病菌菌絲的抑制率。具體步驟:在100mL熔解后冷卻至45C左右的PDA培養(yǎng)基中加入1mL拮抗菌株菌液(含菌量3x108CFU/mL)，混勻后制成含菌平板(約15mL培養(yǎng)基)，然后平板中央接入直徑為8mm的病原真菌菌塊。28C下黑暗培養(yǎng)，設(shè)不接種的為對(duì)照。5和7d分別測(cè)量抑菌圈直徑(mm)和真菌菌落直徑(mm)。抑制率的計(jì)算公式：抑制率(%)=(對(duì)照真菌菌落直徑一受抑制真菌菌落直徑)/對(duì)照真菌菌落直徑x100。采用載玻片懸滴法測(cè)定拮抗菌株對(duì)菠菜霜霉病菌孢子囊萌發(fā)或菠菜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。具體的做法是用直徑為5mm的打孔器在上述抑菌圈邊緣切取菌塊，用定量無(wú)菌水制成孢子囊或分生孢子的懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)算每菌塊中的孢子囊數(shù)或分生孢子數(shù)，以正常培養(yǎng)的病菌菌絲塊為對(duì)照，計(jì)算孢子囊形成或分生孢子形成的抑制率（％）。分別用目標(biāo)菌株培養(yǎng)液（28°C、180rpm、培養(yǎng)48h）和清水配制病原菌孢子囊或分生孢子懸浮液，用載玻片懸滴法室溫培養(yǎng)，觀察孢子囊或分生孢子的萌發(fā)率（%）。2.4.2內(nèi)生性測(cè)定用逐步篩選法，篩選抗利福平的突變菌株，即將供試菌株轉(zhuǎn)入含50^g/mlRif.的NA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取生長(zhǎng)的突變體菌株，再接入同一Rif.濃度的NA培養(yǎng)基，繼代一次后轉(zhuǎn)入下一個(gè)含有2倍Rif濃度的培養(yǎng)基中，直至篩選出抗300rg/mlRif.的并能在NA培養(yǎng)基平板上定生長(zhǎng)且菌落形態(tài)保持不變的抗利福平突變體菌株。把抗Rif突變菌株在含300rg/mlRif.的NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（37C，180r/min）24h，然后用培養(yǎng)液（含菌量約為5X106cfu/ml）噴霧接種菠菜幼苗，接種量為5mL/株。常規(guī)條件下進(jìn)行肥水和栽培管理，以不接菌為空白對(duì)照。3、7、10、14、21和30d分別取樣，每次收集菠菜2g。樣品經(jīng)70%酒精和0.1%升汞表面消毒后，無(wú)菌水沖洗3次，加定量無(wú)菌水研磨勻漿，靜止15min后，吸取適量液體涂于含300rg/mLRif.的NA平板，每處理重復(fù)3次，37C黑暗培養(yǎng)48h，計(jì)算菌落數(shù)。分離時(shí)各處理組織在表面消毒清洗后，于分離平板上進(jìn)行表面印跡培養(yǎng)，48h長(zhǎng)菌的相應(yīng)分離處理為無(wú)效試驗(yàn)。觀察分離菌株在NA平板上的生長(zhǎng)菌落。2.4.3防病測(cè)定拮抗菌株的接種采用噴霧法；菠菜病原菌的接種采用灌根法或針刺法，測(cè)定拮抗菌株對(duì)茶輪斑病的防病效果。接種時(shí)拮抗菌株稀釋成3x108CFU/mL的菌懸液，茶輪斑病菌配成104孢子/mL的孢子懸浮液。設(shè)同時(shí)接種拮抗菌株和菠菜病菌、先接種目標(biāo)菌株24h后接種菠菜病菌和先接種菠菜病菌24后接種拮抗菌株等3個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，以只接種菠菜病菌、只接種清水和只接種培養(yǎng)基的處理為對(duì)照。26C下保濕培養(yǎng)48h后按正常管理，待發(fā)病后，每天記錄發(fā)病情況，將病斑分為五級(jí)，計(jì)算各處理的病情指數(shù)。目標(biāo)菌株防病效果的計(jì)算公式為：防病效果（％）=（病菌對(duì)照的病情指數(shù)一處理的病情指數(shù)）/病菌對(duì)照的病情指數(shù)x100。附錄I培養(yǎng)基配方1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）主要用于細(xì)菌的分離和培養(yǎng)，也可用于細(xì)菌的純化和保存。不加瓊脂粉，即配成營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)液。培養(yǎng)基成分如下：蛋白胨5.0g牛肉浸膏3.0g葡萄糖2.5g酵母粉1.0g瓊脂粉16.0?18.0g蒸餾水1000mlpH7.0?7.2配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱取蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖和酵母粉，溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝試管或三角瓶后，121°C滅菌20min。2Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB）本培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)比較充分，主要用于細(xì)菌的液體培養(yǎng)。加入16.0?18.0g的瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分：酵母粉5.0g胰蛋白胨10.0gNaCl10.0g蒸餾水1000mlpH7.2?7.4配制方法：稱取酵母粉、胰蛋白胨和NaCl，溶于適量蒸餾水；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝試管或三角瓶后，121C滅菌20min。3金氏B培養(yǎng)基（KB）本培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌（熒光假單胞桿菌）的分離。培養(yǎng)基成分：蛋白胨20.0gMgSO4?7H2O1.5gk2hpo4?h2o1.8g純甘油10.0ml瓊脂粉16.0?18.0g蒸餾水1000mlpH7.2?7.4配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱量蛋白胨、MgSO4?7H2O、K2HPO4?H2O和純甘油，溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容

至1000ml。分裝三角瓶后，112°C滅菌30mino4胰蛋白胨大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）胰蛋白腺大豆腺NaCl瓊脂蒸餾水胰蛋白腺大豆腺NaCl瓊脂蒸餾水pH15.0g5.0g5.0g16.0?18.0g1000ml7.2?7.4配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱取胰蛋白腺、大豆月東和NaCl,溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝三角瓶后，121C滅菌20min。5酵母粉瓊脂培養(yǎng)基（YPA）本培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較少，主要用于細(xì)菌的長(zhǎng)期保存。培養(yǎng)基成分：TOC\o"1-5"\h\z酵母粉 3.0gNH4Cl 0.5gKCl 0.2gMgSO47H2O 0.2gK2HPO4 1.0g瓊脂粉 5.0g蒸餾水 1000mlpH 7.0?7.2配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱量酵母粉、NH4Cl、KCl、MgSO4?7H2O和K2HPO4，溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝三角瓶后，112C滅菌30min。6基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）主要用于細(xì)菌糖或醇的利用和分解試驗(yàn)。加入3.0?5.0g的瓊脂粉，可以配成半固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分：TOC\o"1-5"\h\zNH4NO3 1.0gMgSO4.7H2O 0.5g（NH4）2SO4 0.5gKH2PO4 0.5gK2HPO4 1.5gNaCl 0.5g蒸餾水 1000mlpH 7.0?7.2配制方法：先稱取所有藥品，溶于少量熱水，調(diào)節(jié)pH后加入3ml1%漠百里酚藍(lán)水溶液，待呈綠色，再加入糖、醇至終濃度為0.1?0.2%，使之溶解，然后加水定容至1000ml。分裝試管后，121°C滅菌20mino7蛋白胨水培養(yǎng)基主要用于細(xì)菌的糖或醇的發(fā)酵試驗(yàn)，也可用于細(xì)菌的硝酸鹽還原試驗(yàn)。培養(yǎng)基成分：蛋白腺 10.0gNaCl 5.0g蒸餾水 1000mlpH 7.2?7.4配制方法：先稱取蛋白腺和NaCl，溶于少量熱水，調(diào)節(jié)pH后加入溴甲酚紫（1.6%水溶液），待呈紫色，再加入糖、醇或KNO3至終濃度為0.1?0.2%，使之溶解，然后加水定容至1000ml。分裝試管后，最后將杜氏小管倒置放入試管中（觀察試驗(yàn)中是否有產(chǎn)氣）。121C滅菌20min。8馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）主要用于真菌的分離、培養(yǎng)和保存，以及細(xì)菌對(duì)真菌的拮抗測(cè)定。也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA。不加瓊脂粉，即配成PDA培養(yǎng)液。培養(yǎng)基成分：馬鈴薯 200g葡萄糖（或蔗糖） 20.0g瓊脂 16.0?18.0g蒸餾水 1000mlpH 自然配制方法：將馬鈴薯洗凈去皮，稱量，切成小塊，放入鍋中，加蒸餾水1000ml，煮沸30min；稍冷后，用四層紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)粚V液放回鍋中，加入稱好的瓊脂，加熱熔化；然后加入葡萄糖或蔗糖，充分溶解后，補(bǔ)加蒸餾水，定容至1000ml。分裝試管或三角瓶后，121C滅菌20min。1常用緩沖液（1）0.2mol/L磷酸鹽緩沖液pH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/mlpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/ml5.88.092.07.061.039.05.910.090.07.167.033.06.012.387.77.272.028.06.115.085.07.377.023.06.218.581.57.481.019.06.322.577.57.584.016.06.426.573.57.687.013.06.531.568.57.789.510.56.637.562.57.891.58.56.743.556.57.993.07.06.849.551.08.094.75.36.955.045.0注：NaHPO?2HO分子量=178.05,0.2mol/L溶液含35.61g/L；NaHPO?12HO分子量=2 4 2 2 4 2358.22,0.2mol/L溶液含71.64g/L；NaH2PO4?H2O分子量=138.01,0.2mol/L溶液含27.6g/L；NaH2PO4?2H2O分子量=156.03,0.2mol/L溶液含31.21g/L。(2)0.1mol/LTris-HCl緩沖液pHX/mlpHX/ml7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.97.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2注：三羥甲基氨基甲烷（Tris）分子量=121.14,0.1mol/L溶液為12.114g/L。50ml0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tis）溶液于Xml0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。Tris溶液可以從空氣中吸收二氧化碳，使用時(shí)注意將瓶蓋嚴(yán)。(3)0.2mol/L硼酸-硼砂緩沖液pH0.05mol/L硼砂/ml0.2mol/L硼酸/mlpH0.05mol/L硼砂/ml0.2mol/L硼酸/ml7.41.09.08.23.56.57.61.58.58.44.55.57.82.08.08.76.04.08.03.07.09.08.02.0注：硼砂Na2B4O7?10H2O分子量=381.43,0.05mol/L(=0.2mol/L硼酸根)溶液為19.07g/L；硼酸H3BO3分子量=61.84,0.2mol/L溶液為12.37g/L。硼砂易失去結(jié)晶水，必須在帶塞的瓶中保存。(4)0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH0.1mol/L檸檬酸/ml0.1mol/L檸檬酸鈉/mlpH0.1mol/L檸檬酸/ml0.1mol/L檸檬酸鈉/ml3.018.61.45.08.211.83.217.22.85.27.312.73.416.04.05.46.413.63.614.95.15.65.514.53.814.06.05.84.715.34.013.16.96.03.816.24.212.37.76.22.817.24.411.48.66.42.018.04.610.39.76.610418.64.89.210.8注：檸檬酸C6H8O7?H2O分子量=210.14,0.1mol/L溶液含21.01g/L；檸檬酸鈉Na3C6H5O7-2H2O分子量=294.12,0.1mol/L溶液含29.41g/L。(5)0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液pH0.2mol/LNaAc/ml0.2mol/LHAC/mlpH0.2mol/LNaAc/ml0.2mol/LHAC/ml3.60.759.254.85.904.103.81.208.805.07.003.004.01.808.205.27.902.104.22.657.355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.905.105.89.400.60注：NaAc分子量=136.09,0.2mol/L溶液為27.22g/L。2細(xì)菌染色