葡聚糖硫酸鈉誘導uc急性模型濃度及時間的研究

葡聚糖硫酸鈉誘導uc急性模型濃度及時間的研究

近年來，盡管mc的基礎(chǔ)和臨床研究取得了很大進展，但要進一步深入理解mc的病理生理機制，開發(fā)和治療mc的藥物是非常重要的。理想的動物UC模型應(yīng)力求其病因、病理生理、組織形態(tài)及臨床表現(xiàn)近似于人類UC。現(xiàn)在國內(nèi)外應(yīng)用最多的是葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesodium,簡稱DSS)誘導UC模型,本研究重點探索建立此模型所需要的DSS濃度和暴露時間。材料和方法一、材料表面1.動物飼養(yǎng)及分組健康C57BL/6小鼠50只,雄性,體重18～22g,購于上海斯萊克實驗動物中心(許可證號為SCXK2003_0003),所有動物購回后在福建醫(yī)科大學動物房飼養(yǎng)2周,用混合配方飼料(由上海斯萊克實驗動物中心提供)喂養(yǎng),自由進食飲水,每日更換飲水、飲料,保持小鼠生活環(huán)境通風及清潔衛(wèi)生。觀察進食、飲水、活動、大小便情況,確認小鼠健康及適應(yīng)環(huán)境后,開始按照體重隨機分為4組:①正常組(n=8);②3%DSS組(n=14);③5%DSS組(n=14);④8%DSS組(n=14),各組體重統(tǒng)計學比較無顯著差異(P>0.05)。2.oxydmw葡聚糖硫酸鈉dextransulfatesodium,簡稱DSS(MW=36,000～44,000,硫磺含量為18%～20%,MPBiomedicalslnc.CA,USA)。二、方法1.急性uc模型的建立根據(jù)方法建立結(jié)腸炎模型:將DSS溶入蒸餾水,配制成3%、5%、8%(W/V)的DSS溶液,讓C57BL/6小鼠自由飲用6天,建立急性UC模型,正常組飲用蒸餾水作為對照。2.小鼠腸腔炎觀小鼠自由飲用DSS溶液6天后,用頸椎脫臼的方法處死小鼠,迅速剖取結(jié)腸,沿腸系膜剪開,生理鹽水漂洗,開水燙過的毛筆刷去腸腔內(nèi)容物,并將結(jié)腸平鋪于超薄泡沫上,大頭針固定后,肉眼觀察炎癥及潰瘍情況。距肛門及回盲部1.0cm處各取結(jié)腸組織0.5cm,以10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)4μm病理切片(HE染色),顯微鏡下觀察了解結(jié)腸黏膜損傷情況。3.病理組織學檢測(1)疾病活動指數(shù)(DAI)的評估:每日觀察小鼠的體重、大便性狀和隱血情況,按Table1進行評分。將體重下降、大便性狀和隱血情況的評分相加,得出每只小鼠的DAI,以評估疾病活動情況。(2)組織學損傷指數(shù)(HI)的評估:頸椎脫臼法處死小鼠后,剖腹,取肛門至回盲部的結(jié)腸,沿腸系膜緣縱行剖開,肉眼發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腸腔里有鮮血,偶見小糜爛,但是無明顯的潰瘍。每只動物在距肛門及回盲部0.5cm處取1塊組織標本,常規(guī)石蠟包埋、切片(4μm)、HE染色,觀察組織學改變并按Table2評分,HI用黏膜損傷程度及范圍記分的和來表示。(3)病理切片(HE染色)觀察。三、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學分析,各組間的差異比較用t檢驗(方差齊)或者t’檢驗(方差不齊),設(shè)α=0.05,P<0.05為差異有顯著性。小鼠結(jié)腸正常且病理組織學檢測1.一般狀況:飲DSS水后第1天,各組體重增長,飲水和進食較多,3%組有9只小鼠大便出現(xiàn)異常,5%組和8%組所有小鼠大便出現(xiàn)異常;飲用DSS第3天,各組小鼠體重出現(xiàn)下降,飲水和進食明顯減少;飲用DSS第5天,小鼠體重下降很明顯,出現(xiàn)懶動,精神萎靡,體溫下降;飲用DSS的6天,小鼠出現(xiàn)死亡。實驗期間,正常組小鼠大小便正常、體重增加、毛發(fā)有光澤、飲食、活動、精神狀態(tài)均正常。2.實驗組小鼠大便性狀變化(表3)。3.DSS攝取量與結(jié)腸炎的臨床參數(shù)之間的聯(lián)系及組間DAI比較結(jié)果(表4a、表4b)。4.各模型組的病理評分(HI)及組間比較結(jié)果(表5a、表5b)。5.病理切片(HE染色)觀察(附圖)。正常組:小鼠結(jié)腸黏膜完整,黏膜上皮完整、連續(xù),腺體排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)清楚,無炎癥細胞浸潤及潰瘍。模型組:結(jié)腸黏膜不完整,可見多灶性淺潰瘍;大部分腺體被破壞,部分病灶表面上僅少許殘留或完全被破壞,腺體正常結(jié)構(gòu)喪失,排列紊亂,腺腔消失;有炎癥細胞浸潤,以中性粒細胞為主,伴有少量的淋巴、單核細胞,炎癥主要累及黏膜和黏膜下層,少數(shù)可達漿膜層;黏膜下層水腫,可見到淋巴細胞聚集形成淋巴濾泡;在一些病變較輕的部位,可見到部分腺體完整和潰瘍并存。大多數(shù)動物遠端結(jié)腸的損傷比近端結(jié)腸嚴重,某些動物近端結(jié)腸損傷更嚴重。dss模型的臨床應(yīng)用目前常用的UC模型有一下幾種:1.醋酸模型:該法是用濃度為4%～8%的乙酸0.5ml灌腸,作用10～20s后注入5ml的生理鹽水沖洗3次。致炎機理是是應(yīng)用化學刺激造成大鼠結(jié)腸黏膜及血管的直接損傷作用,導致炎癥,猶如UC的急性期表現(xiàn)。醋酸模型類似人類腸道急性炎癥發(fā)作期,尤為適用于觀察中藥療效及評價黏膜愈合機制,但其早期黏膜損傷的非特異性、缺乏慢性期以及易受個體差異(腸道的耐受性不同)的影響為其缺點。2.角叉菜膠模型:該法是用角叉菜膠水溶液飼飲豚鼠、兔、鼠等制出實驗性UC模型。機理是角叉菜膠能夠損傷結(jié)腸上皮細胞間的緊密連接,導致黏膜通透性增加。其優(yōu)點是持續(xù)時間長,急性期3～6周,持續(xù)6～8周,停止飲用角叉菜膠后炎癥持續(xù)1～2周,適合于防治藥物的篩選和研究。缺點是缺少自發(fā)、復發(fā)的特點,且病變部位多集中于盲腸,許多實驗用豚鼠,造價高,不適合于人類免疫學和基因?qū)W方面的研究。3.CD4+T細胞移植、基因敲除和HLA_B27轉(zhuǎn)基因動物模型:此模型可從基因水平上闡明腸道炎癥的發(fā)生,從而直觀地反應(yīng)免疫系統(tǒng)的病因,它表現(xiàn)的炎癥為慢性、持續(xù)性,因而可用來長期監(jiān)測與研究?？墒侵囟嚷?lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠來源困難,價格昂貴,飼養(yǎng)條件高,實驗技術(shù)難度大,要求條件高,暫難推廣。4.三硝基苯磺酸(TNBS)模型:采用將30mgTNBS溶入50%的0.25ml乙醇給SD大鼠灌腸可制造出克隆病模型。其主要致炎機理是乙醇破壞腸粘膜屏障,TNBS滲入結(jié)腸組織與大分子物質(zhì)結(jié)合,形成全抗原,引起腸壁一系列免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。此模型的優(yōu)點是方法簡單,致炎效果好,重復性好,有類似人類克隆病的大體病理及組織學改變,缺點是致炎病程長,個體差異大,是目前常用的克隆病模型之一。DSS模型既可作為研究人類UC的致炎機理及抗炎藥物模型,也可以作為免疫機理及遺傳學研究的模型。從以上實驗結(jié)果也可以看出,一方面其癥狀、體征等一般情況完全符合UC的臨床表現(xiàn);另一方面,此模型小鼠體重變化、大便性狀的改變及疾病活動評分情況,特別是其病理切片的典型病理特征與人類UC變化一致。這些都說明該發(fā)復制的動物模型是成功的、理想的。DSS是由蔗糖合成的一種硫酸多糖體,具有和肝素同樣的抗止血及抗凝血作用。DSS誘發(fā)結(jié)腸炎的具體機制仍不清楚,可能與巨噬細胞功能失調(diào)、腸道菌群失調(diào)及DSS對結(jié)腸上皮的毒性作用有關(guān),也可能與DSS上調(diào)TNF_α,IFN_γ,IL_10的表達及與嗜酸性粒細胞脫顆粒有關(guān)。多項研究證實,DSS_UC模型的成功受以下幾種因素的影響:如①動物的種系;②DSS的濃度;③DSS的分子量;④DSS的暴露時間。其中DSS濃度是本實驗成功的最關(guān)鍵因素,它影響著造模時間及臨床表現(xiàn)。在本實驗中,通過多方檢索,考慮到DSS分子量大小會影響病變部位及小鼠不同種系對DSS的敏感性差異,我們采用分子量為Mr36000～44000的DSS及C57BJ/6小鼠造模,其主要目的是摸索造模濃度及時間。結(jié)果顯示,DAI評分隨著濃度呈線性增加,呈濃度依賴性遠端結(jié)腸HI評分和近端結(jié)腸評分無濃度依賴性,遠端結(jié)腸病變更嚴重。DSS誘導的腸粘膜急性損傷,其程度輕重呈濃度依賴性曾經(jīng)在Balb/c小鼠上得到證實。此實驗中,急性腸黏膜損傷程度輕重與濃度無明顯相關(guān)可能與小鼠的品系不同有關(guān),提示了UC的發(fā)病受遺傳因素的影響。Grangeretal經(jīng)研究給出了DSS攝取量的計算公式DSS(mg/g)=總飲水量(ml)×[DSS(mg)/100ml]/小鼠的初始體重(g),指出誘導可靠和重復性好的UC模型(以組織MPO的活性和組織病理變化為標準),DSS總攝取量的最低閾值是30mg/g體重,只要DSS的負荷量達到30mg/g體重這個關(guān)鍵劑量,DSS總攝入量的差異不會影響炎癥反應(yīng)的嚴重程度。本研究中實驗組小鼠DSS平均攝取量分別為:3%組40.93mg/g體重,5%組60.17mg/g體重、8%組89.42mg/g體重。各組DSS平均攝取量>30mg/g體重,其病理表現(xiàn)無顯著性差異,進一步證實了此結(jié)論。在本實驗中,飲用DSS第5天,各濃度的臨床表現(xiàn)已經(jīng)無明顯差異,但是第6天,各濃度的死亡率相差太大,各組死亡率分別為:3%組為7.1%,5%組為28.6%,8%組為57.1%。解剖腸腔,發(fā)現(xiàn)回盲部和結(jié)腸,甚至空腸、回腸充滿血便,推測可能是嚴重的脫水及肝臟凝血機制損害致結(jié)腸局部病變失血過多而致死亡。其可能的死因已經(jīng)被證實過。未來的研究應(yīng)檢測電解質(zhì)、肝功能及腎功能