黃芩苷和黃芩素在大鼠胃腸吸收動(dòng)力學(xué)研究

黃芩苷和黃芩素在大鼠胃腸吸收動(dòng)力學(xué)研究

黃鼠狼的主要成分是黃鼠狼。它具有廣泛的抗癌、抗炎、抗菌、抗癌、抗癌等藥物特性。研究表明,黃芩苷是黃芩素的復(fù)原型前體藥物,即:黃芩苷在腸內(nèi)經(jīng)過(guò)菌群作用轉(zhuǎn)化為黃芩素而吸收,然后再于體內(nèi)還原為黃芩苷。因此全面比較黃芩苷和黃芩素在各部位的吸收情況,了解它們?cè)诟髂c段的吸收特征,對(duì)提高其口服生物利用度和開發(fā)口服制劑具有重要意義。1材料和方法1.1藥品、試劑和儀器HPLC儀器為L(zhǎng)aballianceSeriesⅢ型等度系統(tǒng):SeriesⅢ型泵、Model500型UV-Vis檢測(cè)器和7725i進(jìn)樣閥;HL-2型恒流蠕動(dòng)泵(上海青浦滬西儀器廠)。黃芩苷和黃芩素對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào)分別為110715-200212和111595-200301;黃芩苷提取物由成都福潤(rùn)德實(shí)業(yè)有限公司提供,批號(hào)為041015,≥90%(HPLC);黃芩素提取物由成都?xì)W康植化科技有限公司提供,批號(hào)為041128,≥95%(HPLC)。甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。Wistar大鼠,雄性,體重200g左右(四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。1.2黃鼠狼的吸收1.2.1進(jìn)一步的濃度人工胃液的配制:按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄配制含胃蛋白酶的人工胃液。Krebs-Ringer試劑(pH7.4,簡(jiǎn)稱K-R試液)的配制:稱取NaCl7.8g,KCl0.35g,CaCl20.37g,NaHCO31.37g,NaH2PO40.32g,MgCl20.02g,葡萄糖1.4g,加水定容至1000mL,即得。黃芩苷乙醇溶液的配制:精密稱取黃芩苷提取物84.89mg,用無(wú)水乙醇稀釋定容至50mL,即得。黃芩素乙醇溶液的配制:精密稱取黃芩素提取物80.1mg,用無(wú)水乙醇稀釋定容至50mL,即得。黃芩苷胃灌注液的配制:精密吸取上述黃芩苷乙醇溶液2mL,再精密加入Tween80(10%)5mL,用人工胃液稀釋定容至100mL,即得。黃芩素胃灌注液的配制:精密吸取上述黃芩素乙醇溶液2mL,再精密加入Tween80(10%)5mL,用人工胃液稀釋定容至100mL,即得。黃芩苷腸灌注液的配制:精密稱取黃芩苷提取物33.8mg、酚紅20.0mg和維生素C2.0g,再精密加入無(wú)水乙醇20mL及Tween80(10%)10mL,用K-R試液稀釋定容至1000mL,即得。黃芩素腸灌注液的配制:精密吸取上述黃芩素乙醇溶液20mL,再精密加入Tween80(10%體積比)10mL、酚紅20.0mg及維生素C2.0g,用K-R試液稀釋定容至1000mL,即得。酚紅液:精密稱取酚紅20.00mg和維生素C2.0g,然后加入乙醇20mL及Tween80(10%體積比)10mL,用水定容至1000mL,即得。1.2.2在體吸收實(shí)驗(yàn)中1.2.2.胃灌注液制備選實(shí)驗(yàn)前禁食1夜(自由飲水),體重200g左右的Wistar大鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉40mg·kg-1,麻醉后固定。切開腹部,暴露胃,在賁門、幽門兩處各切一小口,結(jié)扎賁門,用人工胃液將胃洗凈。吸取胃灌注液4mL并注射到胃內(nèi),結(jié)扎幽門。將胃放回腹腔,用紅外燈保持體溫37℃左右。胃灌注液中藥物濃度為初始濃度。2h后取出胃,將胃內(nèi)藥液轉(zhuǎn)移置10mL量瓶,用人工胃液少量多次地洗滌胃內(nèi)部,洗液一并轉(zhuǎn)入上述量瓶,最后用人工胃液定容,搖勻。此量瓶中藥物濃度作為終濃度,根據(jù)藥物初始藥量和終末藥量之差(初始濃度×初始體積-終濃度×終體積)與時(shí)間的比值計(jì)算其每小時(shí)吸收率。1.2.2.固結(jié)玻璃管制備選實(shí)驗(yàn)前禁食1夜(自由飲水),體重200g左右的Wistar大鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg·kg-1),麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔(約2.5cm),于實(shí)驗(yàn)?zāi)c段兩端各切一小口,在上端小口處插入直徑為0.3cm的玻璃管,并用線扎緊。用注射器將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管,洗去腸管內(nèi)容物至凈。然后在實(shí)驗(yàn)?zāi)c管下端小口處插入玻璃管,并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動(dòng)泵的膠管連接,形成回路,開動(dòng)蠕動(dòng)泵。腸灌注液以5mL·min-1流速循環(huán)10min后,將流速調(diào)節(jié)為2.5mL·min-1,立即自灌注液錐形瓶中取樣1mL,同時(shí)向錐形瓶中補(bǔ)加酚紅液1mL,其后每隔15min亦按同法取樣并補(bǔ)加酚紅液,循環(huán)2h后,中止實(shí)驗(yàn)。樣品10000r·min-1離心5min,取上清液20μL用HPLC法同時(shí)測(cè)定黃芩苷、黃芩素和酚紅的濃度,根據(jù)Fick方程原理對(duì)藥物濃度改變進(jìn)行擬合,求藥物的吸收參數(shù)。2保肝作用大鼠腸道吸收引物多態(tài)性測(cè)定以黃芩苷和黃芩素的胃灌注液進(jìn)行在體胃吸收實(shí)驗(yàn),腸灌注液進(jìn)行在體腸吸收實(shí)驗(yàn),分別得到黃芩苷和黃芩素在大鼠胃、小腸(100cm)和結(jié)腸(10cm)的每小時(shí)吸收率,結(jié)果見表1。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了黃芩素在大鼠十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收情況,表2為黃芩素在各腸段(10cm)的吸收參數(shù)。對(duì)黃芩苷在小腸和結(jié)腸的每小時(shí)吸收率作t檢驗(yàn),P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明黃芩苷在小腸和結(jié)腸雖均基本不吸收,但結(jié)腸仍優(yōu)于小腸。對(duì)黃芩素在各腸段的吸收速率常數(shù)(ka)作t檢驗(yàn),十二指腸、空腸和回腸的ka間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)腸與以上各腸段的ka間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明黃芩素在十二指腸、空腸和回腸的吸收速率相近且均優(yōu)于結(jié)腸。3對(duì)藥物穩(wěn)定性的影響大鼠在體吸收實(shí)驗(yàn)是研究藥物胃腸吸收的重要方法,但是本法只限于溶解性較好、能夠以水溶液狀態(tài)給藥且穩(wěn)定、不被胃腸道吸附和代謝的藥物。黃芩苷和黃芩素均難溶于水,且尤其不溶于人工胃液的酸性環(huán)境。在配制灌注液時(shí),本實(shí)驗(yàn)選用了增溶的方法:即先用少量乙醇溶解藥物,使之呈分子分散狀態(tài)后再加入增溶劑Tween80液(10%體積比),最后再以人工胃液或K-R試液稀釋定容。另外,由于黃芩苷和黃芩素在K-R試液中易被氧化,經(jīng)抗氧效果比較,腸灌注液中選擇VitC作為抗氧劑。為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn),減少實(shí)驗(yàn)步驟,本實(shí)驗(yàn)分別建立了胃、腸灌注液中黃芩苷和黃芩素的同時(shí)測(cè)定法,并分別進(jìn)行了方法學(xué)的考察。黃芩苷和黃芩素在胃、腸灌注液中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,使用本實(shí)驗(yàn)用量的增溶劑和抗氧劑可以得到澄明穩(wěn)定的胃、腸灌注液(2n×2=2×3×2)。黃芩苷和黃芩素的胃、腸吸附實(shí)驗(yàn)表明,藥物在胃腸道無(wú)物理吸附、代謝及攝取(2n×2=2×3×2)。黃芩苷存在體內(nèi)菌群代謝,參與代謝的菌群為厭氧菌群,多分布于盲腸和結(jié)腸。黃芩苷在結(jié)腸的吸收優(yōu)于小腸,由于小腸的長(zhǎng)度數(shù)倍于結(jié)腸,故其在結(jié)腸單位時(shí)間單位長(zhǎng)度的吸收遠(yuǎn)好于小腸,這可能是由于黃芩苷在結(jié)腸菌群作用下轉(zhuǎn)化為更易被吸收的黃芩素而加速了吸收。黃芩素在胃、小腸以及結(jié)腸的吸收均明顯好于黃芩苷,雖然被吸收的部分黃芩素可再以黃芩苷的形式被分泌回到小腸(待發(fā)表資料),結(jié)果仍然提示黃芩素比黃芩苷更適合制成口服吸收