二氫楊梅素對幾種食品微生物的抑菌效果

二氫楊梅素對幾種食品微生物的抑菌效果

微生物污染是影響食品和安全的主要因素之一。據(jù)估計，世界上大約10%或20%的食品損失在腐敗后。添加食品洗滌劑仍然是防止食品腐敗和惡化質(zhì)量的重要手段之一。目前普遍使用的化學(xué)防腐劑存在一定的安全隱患。天然防腐劑是從植物、動物、微生物代謝產(chǎn)物提取的抗菌活性物質(zhì),具有廣譜、高效、低毒等化學(xué)防腐劑無法比擬的優(yōu)點,因而越來越受到人們的青睞,已成為天然產(chǎn)物開發(fā)和食品加工研究領(lǐng)域的熱點。顯齒蛇葡萄俗稱藤茶,是葡萄科蛇葡萄屬的一種野生木質(zhì)落葉藤本植物。不少學(xué)者對藤茶的化學(xué)成分進行了較深入的研究,證實藤茶的主要成分為二氫楊梅素。二氫楊梅素具有很強的氧化能力,能有效抑制細菌等微生物的生長。以往的研究多集中在藤茶和二氫楊梅素的藥理藥效等功能方面,本研究較深入地探討了二氫楊梅素對常見的食品腐敗菌的抑菌活性及其作用條件,旨在探討藤茶提取物二氫楊梅素作為天然食品防腐劑的可能性。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1樣品1.1.2不同病原菌的引起對酵母菌種的認識湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供,其中細菌有大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、溶血性鏈球菌(Hemolytictreptococcus),霉菌有青霉(Penicilliumsp)、黑曲霉(Aspergillusniger),酵母有啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。1.2實驗方法1.2.1準備圓形濾紙將濾紙片用濾紙打孔器制成直徑為6.5mm圓形小濾紙片,高溫蒸氣殺菌后烘干備用。1.2.2原料、消毒和樣品制備實驗中的細菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基的制備、滅菌及平皿制備均參考文獻中方法進行。1.2.3供試菌的制備細菌、酵母菌、霉菌懸液的制備:用接種環(huán)分別挑取3~4環(huán)培養(yǎng)1d的各供試菌于帶玻璃珠的裝有90mL無菌生理鹽水(0.85%)的三角瓶內(nèi),振蕩均勻,制成菌懸液。用稀釋平板記數(shù)法和血球記數(shù)板測定菌數(shù),調(diào)整菌懸液濃度,使其菌懸液濃度為106~107cfu/mL,現(xiàn)配現(xiàn)用。1.2.4抑菌圈直徑測定將樣品用76%乙醇溶解,配成質(zhì)量濃度分別為7.04、10.56、13.20g/L的二氫楊梅素乙醇溶液,傾少量于已滅菌的瓶內(nèi)。將已滅菌烘干的圓濾紙片浸入不同濃度的溶液中6~8h后,用無菌鑷子夾出,貼于含菌平皿中。一個平皿貼3片含樣品藥液的濾紙片,呈正三角形。平皿中間貼一個用76%乙醇浸泡同樣長時間的濾紙片,作為對照。將加好藥液的平皿置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細菌于37℃培養(yǎng)24h,酵母、霉菌于28℃培養(yǎng)48h,取出觀察,測定抑菌圈直徑。重復(fù)3次。1.2.5最低抑菌濃度測定按文獻介紹的試管2倍稀釋法進行。具體操作是:取6支試管,于每一支試管內(nèi)加入培養(yǎng)液2mL(滅菌121℃,30min)。吸取2mL藥液(二氫楊梅素濃度為7.04g/L)到第1管內(nèi),充分混勻后吸出2mL到第2管中,依次稀釋到第6管。第6管充分混勻后吸出2mL混合液丟棄。再向每一管內(nèi)分別加菌懸液0.05mL(菌液濃度106~107cfu/mL)搖勻后細菌置37℃培養(yǎng)24h取出觀察。以能抑制細菌生長繁殖的藥液最高稀釋度為該藥的最低抑菌濃度。將上述稀釋度在MIC以前(包括MIC)的各菌藥混合管取0.1mL轉(zhuǎn)接于瓊脂平板上,用無菌玻璃刮鏟涂抹均勻后,細菌于37℃培養(yǎng)24h,酵母、霉菌于28℃培養(yǎng)48h,取出觀察結(jié)果,以仍沒菌生長的最高藥物稀釋度為該藥的最低殺菌濃度,重復(fù)3次。1.2.6不同ph下二氫楊樹葉片的抑菌效果將質(zhì)量濃度為10.56g/L二氫楊梅素用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)成6個pH梯度(3~4、4~5、5~6、6~7、7~8、8~9),用上述1.2.4介紹的方法做抑菌圈的測定,觀察不同pH下二氫楊梅素抑菌效果的變化,重復(fù)3次。1.2.7溫度對二氫楊樹莓原汁抑菌活性的影響將二氫楊梅素用76%乙醇稀釋成質(zhì)量濃度為10.56g/L的藥液,藥液121℃處理10min,用上述1.2.4介紹的方法觀察溫度對二氫楊梅素抑菌活性的影響,重復(fù)3次。2結(jié)果與分析2.1不同菌種的抑制作用本研究的結(jié)果顯示,不同質(zhì)量濃度的二氫楊梅素對供試的霉菌和酵母無明顯的抑制作用,而對各種供試的細菌,無論是球菌和桿菌,革蘭陰性菌和革蘭陽性菌,都有明顯的抑制效果,結(jié)果見表1。2.2抑菌濃度的測定由表2可知,二氫楊梅素對各種供試細菌具有較低的抑菌濃度,對枯草芽孢桿菌和鏈球菌的最低抑菌濃度為1.74g/L,對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.22g/L,而對金黃色葡萄球菌的抑菌濃度更低,小于0.11g/L。由表3可知,樣品對鏈球菌和枯草芽孢桿菌的最低殺菌濃度高于3.52g/L,對大腸桿菌和金黃色葡萄球的最低殺菌濃度分別是1.74g/L和0.88g/L。從表2和表3數(shù)據(jù)分析,二氫楊梅素具有廣譜抑菌、殺菌的效果,其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度較低,這些指標(biāo)顯示了其作為天然食品添加劑的前景。2.3酸性環(huán)境內(nèi)二氫楊樹莓原汁酸性溫度對抑菌活性的影響由表4可知,pH對二氫楊梅素抑菌活性的影響較大,在不同的pH環(huán)境下,二氫楊梅素對不同細菌的抑菌活性有差異,但總的來說,其在酸性環(huán)境中抑菌活性較強。二氫楊梅素抑菌活性在偏酸性的條件下比中性及堿性條件下的抑菌作用較強的原因,可能是在酸性條件下,細菌對外界不良環(huán)境的抵抗力減弱,增強了二氫楊梅素的抑菌效果;另一方面,二氫楊梅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)在酸性條件下電離程度增大,使其溶解性能增加,導(dǎo)致有效濃度增加,從而抑菌效果更佳。2.4高溫對二氫楊樹莓原汁抑菌圈和穩(wěn)定性的影響用10.56g/L的二氫楊梅素溶液在121℃條件下處理10min后,4種菌的平均抑菌圈直徑與表1中同濃度溶液抑菌圈直徑基本相同,說明高溫作用后,二氫楊梅素的抑菌活性基本沒有變化,二氫楊梅素具有良好的熱穩(wěn)定性。3氫楊素的抑菌效果熊大勝等人用顯齒蛇葡萄幼嫩莖葉提取物進行抑菌實驗結(jié)果表明,其對金黃葡萄球菌、枯草桿菌均有很強的抑制作用,對黑曲霉、黃曲霉、青霉等均有不同程度的抑制效果。熊皓平等人的研究結(jié)果是藤茶醇提取物對各種真菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果。楊書珍等的研究表明:二氫楊梅樹皮素對牛奶酸敗菌和青霉菌具有明顯的抑制作用,對酵母菌的抑制效果不顯著。從本研究的結(jié)果看,二氫楊梅素對酵母和霉菌的抑制效果不明顯,對細菌有較強的抑制作用。各研究結(jié)果基本上都說明二氫楊梅素對細菌有較強的抑制作用,但對酵母和霉菌的抑制效果各研究的結(jié)果并不一致。這些實驗結(jié)果不一致的原因可能是所采用的實驗樣品的來源和有效成分含量不同所致,熊皓平采用的是顯齒蛇葡萄鮮葉的95%乙醇浸提物,熊大勝等人采用的是顯齒蛇葡萄幼嫩莖葉提取物。不同的提取方法和純化程度不一樣可能導(dǎo)致樣品中的有效成分含量不一,另外,顯齒蛇葡萄其他成分的抗菌活性或者對二氫楊梅素對抗菌活性是否存在增效作用也是值得研究的問題。二氫楊梅素集抑菌、保健作用于一體,具有作為天然食品添加劑開發(fā)的潛力,但由于二氫楊梅素微溶于水而溶于乙醇,未來如用二氫楊梅素來作為食品添加劑開發(fā)時,應(yīng)考慮二氫楊梅素在食品中的溶解性。