拉米夫定在健康人體的藥代動力學(xué)研究

拉米夫定在健康人體的藥代動力學(xué)研究

拉米夫丁是英國格蘭斯韋康公司開發(fā)和開發(fā)的一種慢性肝炎藥物。它是山羊病毒逆轉(zhuǎn)酶抑制劑。它的化學(xué)名字是2、3、雙氧化氯仿3-硫醇基。臨床上用于治療慢性乙型肝炎感染。到目前為止,在世界范圍內(nèi)已有超過3000名慢性乙型肝炎病人接受過拉米夫定的藥物治療,超過80名健康受試者參加了I期臨床研究。這些臨床研究的結(jié)果顯示,給予慢性乙型肝炎病人100mg拉米夫定,每日1次時(shí)療效最好,故將此劑量定為臨床應(yīng)用的推薦劑量。為了了解拉米夫定在國人體內(nèi)的藥代動力學(xué)情況,我們測定了一組中國健康男女受試者在口服100mg拉米夫定后的藥代動力學(xué)情況。材料和方法1.夫定標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)拉米夫定100mg片劑(批號T97/169A)、拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)carbovir均由英國葛蘭素威康公司提供。BiositeTriageTM藥盒,Merck公司產(chǎn)品。國產(chǎn)試劑乙腈、甲醇等為色譜純,其余化學(xué)試劑均為分析純。2.hplc測定本研究所用HPLC系統(tǒng)由Waters600E泵、Waters486紫外檢測器、Waters712DWISP自動進(jìn)樣器、WatersTCM柱溫箱以及WatersPC800積分軟件組成。HPLC條件如下:色譜柱為hypersilC18柱(5μm粒徑,25cm×4.6mm);測定血漿樣品時(shí)流動相由8%甲醇、0.1%乙酸、1%乙腈溶于100mmol·L-1乙酸胺水溶液中組成,測定尿樣品時(shí)流動相由10%甲醇、0.1%乙酸溶于100mmol·L-1乙酸胺水溶液中組成;流速為1.0ml·min-1;柱溫50℃;檢測波長270nm。3.研究對象的選擇受試者的選擇根據(jù)衛(wèi)生部藥政局發(fā)布的《新藥臨床研究指導(dǎo)原則匯編》中對藥代動力學(xué)研究的技術(shù)要求進(jìn)行,本研究選擇了除孕婦、老年人、兒童外的健康志愿受試者24名,其中男性12人,女性12人。年齡在19～40歲之間。平均體重為58.2±10.0kg,平均身高1.66±8cm。所以志愿者在簽署知情同意書以后,經(jīng)病史、體檢及實(shí)驗(yàn)室等檢查正常后入選。4.試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用開放、多次給藥試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行本項(xiàng)藥代動力學(xué)研究。5.口服100.拉米夫定片整個(gè)試驗(yàn)期間所有受試者均留住于北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心I期臨床試驗(yàn)病房,無論是否由試驗(yàn)藥物引起的任何藥物不良反應(yīng)均由醫(yī)護(hù)人員記錄、報(bào)告并及時(shí)處理。試驗(yàn)期間不能服用除撲熱息痛外的任何藥物,不能飲用可樂、茶等飲品,不能進(jìn)行劇烈運(yùn)動所有受試者入組后均在第次服藥前夜及第7次服藥后2周內(nèi)再次進(jìn)行體檢(體溫、血壓、心率測定)及心電圖檢查,并在第7次服藥后2周內(nèi)進(jìn)行血常規(guī)、尿常規(guī)及化驗(yàn)室檢查。受試者每天口服100mg拉米夫定片一次,試驗(yàn)持續(xù)7d。試驗(yàn)前1d受試者禁食過夜。受試者于試驗(yàn)第1d清晨一次空腹口服100mg拉米夫定片及200ml水,并于服藥前、后按設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)采集前臂靜脈血6ml;取血1h后離心分出血清,保存于-70℃冰箱至測定。此外受試者需留0,0～12h,12～24h尿并記錄尿量,然后各取10ml保存于-70℃冰箱至測定。受試者于服藥后2h可飲用礦泉水、白開水,并于服藥后4h進(jìn)中餐、8h進(jìn)少量零食、10h進(jìn)晚餐。中、晚餐為統(tǒng)一清淡低次黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)餐。試驗(yàn)第7d,受試者重復(fù)試驗(yàn)第1d的采血過程,并按同樣食譜在同樣時(shí)間進(jìn)食、進(jìn)水。試驗(yàn)第2～6d,受試者每天清晨一次口服100mg拉米夫定片及200ml水。6.血液和尿液樣本的測定6.1血液中拉米夫測定的測定6.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作精密量取一定量空白血漿置50ml具塞試管中,分別加入拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液(10mg·L-1)配成0.01,0.02,0.05,0.2和1mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,然后按每份1.0ml將所配樣品分裝,貯存于-70℃冰箱備用。質(zhì)控樣品制備方法同上,拉米夫定濃度為0.02,0.1及0.8mg·L-1。6.1.2內(nèi)標(biāo)溶液的制備方法先將內(nèi)標(biāo)carbovir配成1g·L-1的水溶液,然后用1%乙酸稀釋至0.75mg·L-1。6.1.3樣品的制備和分離精密量取血漿樣品1.0ml,置5ml試管中,精密加入內(nèi)標(biāo)溶液(750μg·L-1)1.0ml,充分振蕩后轉(zhuǎn)移至經(jīng)2ml甲醇和2ml1%乙酸活化過的BondElutCertifyLRC(130mg,10ml)固相萃取柱(Varian,HarborCity,CA,USA),待上柱樣品在真空吸引下滴干后,依次用2ml1%乙酸,2ml甲醇-10%乙酸液(9:1,v/v)及2ml去離子水淋洗萃取柱,并棄去淋洗液。最后用0.5ml甲醇-三乙胺液(99:1,v/v)連續(xù)洗脫4次并收集全部淋洗液至干凈樣品管,70℃下用氮?dú)饩徦俅蹈?。殘?jiān)?00μl流動相溶解后,在HPLC條件下分離測定制備后的血漿樣品,進(jìn)樣量100μl。記錄色譜圖及拉米夫定與內(nèi)標(biāo)的峰高比。6.1.4同對比和質(zhì)控樣品的制備同血漿樣品的處理與測定。同一位受試者第1d和第7的血漿樣品在同一批內(nèi)測定每批樣品包括一條標(biāo)準(zhǔn)曲線和6個(gè)均勻分布在待測樣品中的質(zhì)控樣品(低、中、高三種濃度各2個(gè))。6.1.5加標(biāo)回收率測定分別于1ml空白血漿中加入不同量拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液配成從低至高4種濃度拉米夫定的血漿樣品(0.01,0.02,0.05和1mg·L-1),按血漿樣品的處理與測定方法操作,依法測定回收率。6.1.6精密度與準(zhǔn)確度分別于1ml空白血漿中加入不同量拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液配成從低至高4種濃度拉米夫定的血漿樣品(0.01,0.02,0.05和1mg·L-1),按血漿樣品的處理與測定方法操作,測定日內(nèi)與日間(4d內(nèi))精密度。6.2拉米夫測定排尿率6.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密量取一定量空白尿置50ml具塞試管中,分別精密加入拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液(1g·L-1)配成1,5,20,50和100mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,然后按每份1.0ml將所配樣品全部分裝,貯存于-70℃冰箱備用。質(zhì)控樣品制備方法同上,拉米夫定濃度為3,5及75mg·L-1。6.2.2尿樣品的分離取尿樣品1.0ml,置5ml試管中,3000g離心10min,取上清在上述HPLC條件下分離測定尿樣品,進(jìn)樣量100μl。記錄色譜圖及拉米夫定的峰高。6.2.3尿樣品檢測同尿樣品的處理與測定。所有受試者的尿樣品在同一批內(nèi)測定,并包括標(biāo)準(zhǔn)曲線和6個(gè)均勻分布在待測樣品中的質(zhì)控樣品(低、中、高三種濃度各2個(gè))。6.2.4加標(biāo)回收率的測定分別于1ml空白尿中加入不同量拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液配成從低、中、高3種濃度拉米夫定的尿樣品(3,5及75mg·L-1),按尿樣品的處理與測定方法操作,依法測定回收率。7.藥代動力學(xué)參數(shù)血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)WinNonlin(ScientificConsulting,Inc)程序進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。第1d與第7d藥代動力學(xué)參數(shù)的比較采用配對t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果1.線性關(guān)系和方法的最低檢測限1.1按選定的HPLC條件,測得空白血漿及血漿樣品的色譜圖,見圖1a、1b。由圖可見血漿中物質(zhì)在本試驗(yàn)的HPLC條件下對拉米夫定和carbovir的分離測定無任何影響。1.2將標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下測得的不同濃度拉米夫定系列樣品的拉米夫定與內(nèi)標(biāo)峰高之比為縱坐標(biāo),拉米夫定濃度為橫坐標(biāo),直線回歸。結(jié)果表明血漿中拉米夫定濃度在0.01～1mg·L-1范圍內(nèi),濃度與峰高比有良好的線性關(guān)系,試驗(yàn)期間共制備標(biāo)準(zhǔn)曲線35條,所有曲線γ2值范圍均在0.999～1.000之間。1.3方法的最低檢測限與最低檢測濃度:本方法的最低檢測限與最低檢測濃度分別為1ng和0.01mg·L-1。1.4將回收率試驗(yàn)項(xiàng)下的樣品測定值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算出拉米夫定濃度。以測得值與加入值之比計(jì)算回收率,4種濃度的平均回收率為98.9%±4.3%(n=24)。1.5表1顯示了日內(nèi)和日間精密度的測得結(jié)果。1.6表2顯示了本法測定的不同濃度拉米夫定均值的95%可信限。2尿中拉米夫定檢測2.1按選定的HPLC條件,測得的空白尿及尿樣品的色譜圖,見圖1c、d。由圖可見尿中物質(zhì)在本試驗(yàn)HPLC條件下對拉米夫定的分離測定無任何影響。2.2將標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下測得的不同濃度拉米夫定系列樣品的拉米夫定峰。高作為縱坐標(biāo),拉米夫定濃度為橫坐標(biāo),直線回歸。結(jié)果表明尿中拉米夫定濃度在1.0～100mg·L-1范圍內(nèi),濃度與峰高有良好的線性關(guān)系,試驗(yàn)期間共制備標(biāo)準(zhǔn)曲線7條,所有曲線γ2值范圍均在0.999～1.000之間。本方法的最低濃度為1.0mg·L-1。將回收率試驗(yàn)項(xiàng)下的樣品測定值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算出拉米夫定濃度。以測得值與加入值之比計(jì)算回收率,三種濃度的平均回收率為103.8%±5.0%(n=6)。3.藥代動力學(xué)程序3.1連續(xù)口服單劑量100mg拉米夫定片劑第1d和第7d的經(jīng)時(shí)血藥濃度數(shù)據(jù)均值繪制的藥-時(shí)曲線見圖2。3.2經(jīng)Win-Nonlin藥代動力學(xué)程序?qū)ρ帩舛葦?shù)據(jù)進(jìn)行處理,按有滯后時(shí)間的非房室模型(noncompartmentalmodel)擬合,連續(xù)口服100mg拉米夫定片劑第1d和第7d的藥代動力學(xué)參數(shù)見表3。3.3圖3顯示了中國健康男女受試者口服單劑量100mg拉米夫定片劑第1d尿中拉米夫定的排出,結(jié)果顯示,在服藥后24h內(nèi)以原形排入尿中的拉米夫定占給藥劑量的78.92%±11.03%。4.統(tǒng)計(jì)分析用配對t檢驗(yàn)法分析受試者連續(xù)口服單劑量100mg拉米夫定片劑第1d和第7d的藥代動力學(xué)參數(shù),結(jié)果表明二者無顯著性差異。藥代動力學(xué)參數(shù)本研究根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn),建立了穩(wěn)定的測定拉米夫定的方法。通過方法學(xué)的考核,所有分析指標(biāo)都能滿足本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)以及常規(guī)藥物定量分析的要求。拉米夫定是用于治療乙型肝炎的藥物,如果在臨床上長期使用,