第十二章 基因敲除技術(shù)

第十二章

基因敲除技術(shù)

基因敲除（Knockout）又稱為基因打靶，是指人為地從DNA分子水平上去除或替換某一個基因，使細(xì)胞內(nèi)的某種特定遺傳信息無法再表達(dá)，進(jìn)而從整體水平或細(xì)胞水平推測相關(guān)基因功能的一種技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)起源于20世紀(jì)80年代，是在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemcell，ES)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?；蛲粗亟M技術(shù)是指當(dāng)外源DNA片段大且與宿主基因片段同源性強(qiáng)者并互補(bǔ)結(jié)合時，結(jié)合區(qū)的任何部分都有與宿主的相應(yīng)片段發(fā)生交換(即重組)的可能，因此這種重組技術(shù)又稱為同源重組?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材所謂胚胎干細(xì)胞是從著床前胚胎(孕3—5天)分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercellmass，ICM)細(xì)胞，它具有向各種組織細(xì)胞分化的多分化潛能，能在體外培養(yǎng)并保留發(fā)育的全能性。在體外進(jìn)行遺傳操作后，將它重新植回小鼠子宮，該細(xì)胞能發(fā)育成胚胎的各種組織乃至于一個個體。基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一特定位點(diǎn)上，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一目的基因的一種技術(shù)。它包括如下主要步驟：①構(gòu)建重組載體；②重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)；③篩選目的細(xì)胞；④轉(zhuǎn)基因動物。這種方法的出現(xiàn)克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材該項技術(shù)的誕生是分子生物學(xué)技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發(fā)展將為發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)等學(xué)科提供了一個全新的、強(qiáng)有力的研究、治療手段，具有廣泛的應(yīng)用前景?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材一、Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)基因敲除的重組載體系統(tǒng)主要有插入性載體系統(tǒng)和替換性載體系統(tǒng)。插入性載體系統(tǒng)構(gòu)建載體時主要包括：要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、標(biāo)志基因片段等成分；替換性載體系統(tǒng)主要包括：同源序列片段、替換基因的啟動子和報道基因等成分。Tsien等于1996年在《Cell》首先報道了第一個腦區(qū)特異性的基因敲除動物，被譽(yù)為條件性基因敲除研究的里程碑。該技術(shù)以Cre/LoxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，因為Cre在哪種組織細(xì)胞中表達(dá)，基因敲除就能夠發(fā)生在哪種組織細(xì)胞中。下面就Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)的基本原理做簡要介紹。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材Cre-LoxP系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體,但是具有了時空調(diào)控的功能。它由Cre重組酶和LoxP位點(diǎn)兩部分組成。Cre重組酶于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp，編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列同樣來源于P1噬菌體，是有兩個13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。當(dāng)兩個loxP序列方向相同并且位于同一條染色體上時，Cre編碼的重組酶蛋白能夠?qū)⑾嗤较虻膌oxP位點(diǎn)之間的核苷酸序列切除成為游離態(tài)，即有效切除兩個loxP位點(diǎn)之間的核苷酸序列；當(dāng)兩個LoxP的序列相反時，Cre重組酶使兩個loxP序列顛倒，并且這兩種反應(yīng)處于一種平衡狀態(tài)；當(dāng)兩個LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上面時，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條DNA的交換或促使染色體易位?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材Cre重組酶能識別34bp的部分回文的loxP序列，介導(dǎo)LoxP的34bp重復(fù)序列的位點(diǎn)特異性重組,切除同向重復(fù)的2個LoxP位點(diǎn)間的DNA片段和1個LoxP位點(diǎn)，同時保留1個LoxP位點(diǎn)，從而使兩個loxP位點(diǎn)之間的序列發(fā)生特異性的重組或刪除。該特性從而使得Cre-Loxp系統(tǒng)廣泛用于條件性基因敲除的研究?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材圖11-4Cre-LoxP介導(dǎo)的基因表達(dá)啟動或關(guān)閉機(jī)制“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材Cre不僅可以識別LoxP的2個13bp的反向重復(fù)序列和8bp的間隔區(qū)域，而且當(dāng)一個13bp的反向重復(fù)序列或者8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變時仍能識別并發(fā)生重組。利用這一特點(diǎn)，人們在進(jìn)行構(gòu)建載體時可以根據(jù)需要改造LoxP位點(diǎn)序列用于基因突變或修復(fù)，增加了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。重組酶介導(dǎo)的盒式交換(recombinasemediatedcas-setteexchange,RMCE)方法就是以8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變?yōu)榛A(chǔ)構(gòu)建的，同時結(jié)合盒式交換來突現(xiàn)動物的表型而易于鑒別?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材與傳統(tǒng)的重組載體相比較，Cre-LoxP的不同點(diǎn)包括：在被Cre重組酶介導(dǎo)的重組發(fā)生前內(nèi)源基因功能正常，對基因組的任何改造必須位于編碼區(qū)以外或者內(nèi)含子區(qū)并且不干擾調(diào)節(jié)區(qū)域的功能；根據(jù)刪除片段的要求改變LoxP位點(diǎn)的插入方式可以得到不同的重組體；每段被改造的DNA片段都含有酶切位點(diǎn)便于用Southern印跡證實；便于區(qū)分打靶后不同細(xì)胞類型(野生型、打靶但未重組型、重組型)的顯像策略?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材Cre-LoxP系統(tǒng)既可以用在細(xì)胞水平上，將Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中，通過識別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在整體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，再通過二代遺傳就可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性基因敲除子代小鼠。例如，應(yīng)用該系統(tǒng)刪除小鼠X染色體雄激素受體基因產(chǎn)生雄激素受體基因缺失小鼠，就能夠闡述雄激素受體的功能是正常雌性動物生產(chǎn)能力所必需的機(jī)理，進(jìn)一步說明雄激素受體是一種治療卵巢功能早衰的潛在的靶基因。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材Cre-LoxP系統(tǒng)還可以用于染色體間的基因重排。通過在特異性位點(diǎn)同源重組導(dǎo)入含有LoxP序列的5′Hprt框，然后隨機(jī)整合含有LoxP序列的3′Hprt框，結(jié)果在Cre酶的作用下，兩個LoxP位點(diǎn)之間發(fā)生重組，形成具有功能的Hprt微小基因，使重組后的ES細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中存活下來。這種染色體重排為染色體功能圖譜的制作提供了一個很好的技術(shù)手段。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材Cre-LoxP系統(tǒng)可以實現(xiàn)對基因的不同發(fā)育階段、不同組織類型中特異性的刪除，可以消除由于基因位置改變造成的影響，加強(qiáng)了對基因的控制能力，使研究者可以更方便地有針對性地進(jìn)行目標(biāo)階段的研究工作。Cre-Loxp介導(dǎo)的條件基因打靶動物模型需要以下途徑：①用Cre表達(dá)載體轉(zhuǎn)染含有Loxp位點(diǎn)的胚胎干細(xì)胞；②利用顯微注射法將Cre表達(dá)載體注入含Loxp位點(diǎn)的受精卵細(xì)胞；③基因中表達(dá)Cre重組酶的小鼠與基因組中引入loxP序列的小鼠雜交，篩選出雙重轉(zhuǎn)基因鼠。“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材1.基因敲除技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用基因敲除小鼠模型的建立使許多與人類疾病相關(guān)的新基因的功能得到闡明，基因敲除可用于建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，為醫(yī)學(xué)研究提供材料。使現(xiàn)代生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。從基因敲除技術(shù)出現(xiàn)至今已生產(chǎn)的基因敲除小鼠模型已有很多，如：包括與癌基因和腫瘤抑制基因、免疫相關(guān)基因、生長因子與受體基因，這些模型的建立為治療人類疾病如：腫瘤、動脈粥樣硬化和糖尿病和遺傳性疾病等提供了極大的幫助?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材2.基因敲除技術(shù)在改造動植物基因中的應(yīng)用通過基因敲除技術(shù)可以鑒定新基因和尋找新的蛋白質(zhì)功能，為研究基因的功能和生物效應(yīng)提供模式。3.基因敲除技術(shù)在動植物育種中的應(yīng)用通過基因敲除可以對動植物的基因進(jìn)行修飾和改造，生產(chǎn)出一些人類需要培育的生物新品種，它將為人類改良家畜、家禽的性狀和品質(zhì)和解決糧食等相關(guān)重大問題帶來巨大的機(jī)遇?！笆濉逼胀ǜ叩冉逃龂壹壱?guī)劃教材本章小結(jié)“十二五”普通高等教育國家級規(guī)劃教材基因敲除（gene

knockout）技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一門新技術(shù)。應(yīng)用DNA同源重組技術(shù)將滅活的基因?qū)胄∈笈咛ジ杉?xì)胞（embryonic

stem

cells，ES

cells）以取代目的基因，再篩選出已靶向滅活的細(xì)胞