疏肝理氣法對實驗性功能性消化不良大鼠下丘腦和胃竇胃泌素、生長抑素表達(dá)的影響

疏肝理氣法對實驗性功能性消化不良大鼠下丘腦和胃竇胃泌素、生長抑素表達(dá)的影響

功能障礙（fd）是最常見的消化疾病。大量的文獻(xiàn)報道及臨床實踐顯示,中醫(yī)疏肝理氣法為主治療本病具有較好效果,其作用可能與促胃動力有關(guān),但其確切機制尚不清楚。本實驗通過夾尾激惹刺激法制造FD大鼠模型,觀察柴胡疏肝散對其下丘腦和胃竇胃泌素、生長抑素表達(dá)的影響,以期從中樞及外周腦腸肽角度探討疏肝理氣法治療消化不良的作用機制。1動物模型的制作清潔級8周齡雌性Wistar大鼠32只,體重(180±20)g(廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。大鼠隨機分成正常對照組、模型組、柴胡疏肝散組,嗎丁啉組,每組8只。除正常組外,其余各組參照根據(jù)文獻(xiàn)加以改進(jìn),采用夾尾激惹刺激法制造FD大鼠模型,方法是束縛布包止血鉗鉗夾標(biāo)記鼠鼠尾,立即放開,每次30min,每天2次,持續(xù)3周。經(jīng)典原方柴胡疏肝散由柴胡、白芍、枳殼、川芎、香附、甘草組成,將以上藥物按成人(60㎏)臨床用藥量的10倍,按1∶5容積比,用蒸餾水浸泡30min,煎煮2次(30min/次)后,過濾,去渣取汁,合并濾液加熱蒸發(fā),制成141%水煎濃縮液(每毫升含生藥1.41g),4℃保存待用。嗎丁啉(西安楊森制藥有限公司,10mg/片),臨用時加蒸餾水制成0.2g·L-1的溶液。生長抑素免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;胃泌素免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS緩沖液均購自福建邁新生物工程公司。2免疫組化染色32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,于造模同一天開始灌胃,正常組和模型組分別予0.9%NaCl溶液灌喂(每100g體重予1.5mL),柴胡疏肝散組、嗎丁啉組分別予柴胡疏肝散水煎液、嗎丁啉溶液灌胃,每100g體重每次1.5mL,早晚各1次。共喂藥3周。處死大鼠前禁食不禁水24h,在試驗第22d,所有大鼠用3%戊巴比妥鈉(每200g體重1mL)腹腔麻醉,剖腹取胃,斷頭取腦。10%福爾馬林固定,常規(guī)包埋,切片,免疫組化檢測用。采用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,操作按照試劑盒說明書進(jìn)行,鼠抗GAS單克隆抗體,工作濃度為1:100;兔抗SS多克隆抗體,工作濃度為1∶150。以PBS代替一抗作為陰性對照。以試劑公司提供的陽性對照片作為陽性對照。光鏡下觀察陽性染色細(xì)胞定位。以胞漿或胞膜出現(xiàn)棕黃色至深棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。以病理圖像分析系統(tǒng)采圖并進(jìn)行圖像分析,表達(dá)水平以面積密度(areadensity,AD)表示.所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SSPS13.0統(tǒng)計軟件處理,并以xˉ±sxˉ±s表示,采用單因素方差分析。P<0.05顯示有統(tǒng)計學(xué)意義。3對胃竇和胃竇gas表達(dá)的影響GAS在下丘腦主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿,呈橢圓、三角形或多邊形棕黃色顆粒,在胃竇主要表達(dá)在黏膜層的上皮細(xì)胞的胞漿中,呈圓形或橢圓形棕色顆粒,2個部位均以正常組GAS陽性細(xì)胞分布較多,嗎丁啉組、模型組GAS陽性細(xì)胞在下丘腦分布較少,柴胡疏肝散組GAS陽性細(xì)胞較二者增多;在胃竇中模型組較少,柴胡疏肝散組和嗎丁啉組較模型組增多。SS在下丘腦定位于神經(jīng)元細(xì)胞的胞膜和(或)胞漿上,在胃竇中,SS主要表達(dá)在黏膜層的上皮細(xì)胞的胞漿中,呈圓形或橢圓形棕褐色顆粒。模型組下丘腦和胃竇SS陽性細(xì)胞較正常對照組增多,嗎丁啉組和柴胡疏肝散組下丘腦SS陽性細(xì)胞與模型組無明顯差別,而在胃竇中的陽性細(xì)胞較模型組減少(圖1～8)。與正常組比較,模型組下丘腦和胃竇GAS表達(dá)顯著減弱(P<0.01);柴胡疏肝散組下丘腦和胃竇GAS表達(dá)均較模型組顯著增強(P<0.05,P<0.01),嗎丁啉組胃竇GAS表達(dá)亦較模型組顯著增強(P<0.01),嗎丁啉組下丘腦GAS表達(dá)則和模型組無顯著差異。與正常組比較,模型組下丘腦和胃竇SS表達(dá)顯著增強(P<0.01);柴胡疏肝散組和嗎丁啉組胃竇中SS均較模型組顯著下降(P<0.01),柴胡疏肝散組和嗎丁啉組下丘腦SS表達(dá)則和模型組無顯著差異(表1)。3胡蘿卜干粉對fd大鼠腦腸肽和ss的調(diào)治作用腦腸肽不僅通過體液途徑或作為腸道神經(jīng)系統(tǒng)的遞質(zhì)在外周對胃腸運動功能進(jìn)行調(diào)節(jié),還可通過影響迷走神經(jīng)環(huán)路在中樞水平發(fā)揮作用,表明在體內(nèi)內(nèi)分泌和神經(jīng)2個調(diào)節(jié)系統(tǒng),可能作為一個統(tǒng)一的整合系統(tǒng)——神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)而起作用。而中醫(yī)認(rèn)為,肝主疏泄,具有調(diào)理氣機,調(diào)暢情志,助脾胃運化,通利氣血的作用,這相當(dāng)于西醫(yī)的神經(jīng)-內(nèi)分泌-消化系統(tǒng)等部分的功能集合?？梢哉J(rèn)為中醫(yī)肝主疏泄理論與西醫(yī)腦腸肽理論可以說某種程度上是異曲同工,殊途同歸,均注重有機整體,相互關(guān)照,中醫(yī)“肝主疏泄”的功能可能是調(diào)節(jié)腦腸肽的核心,疏肝為主方藥能調(diào)節(jié)FD胃組織或外周血水平。本研究選取的SS和GAS是2種典型的腦腸肽,它們雙重分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化道。SS在中樞神經(jīng)系統(tǒng),主要存在于下丘腦,在消化系統(tǒng),主要分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)、胃體和胃竇黏膜內(nèi)的D細(xì)胞中,其可抑制多種胃腸激素如GAS、胃動素和膽囊收縮素等的分泌和釋放,抑制胰腺的外分泌和膽汁分泌,抑制胃腸運動和膽囊收縮。下丘腦是自主神經(jīng)的皮質(zhì)下中樞,也是情感的皮質(zhì)下中樞,SS水平與抑郁嚴(yán)重度呈明顯負(fù)相關(guān),即抑郁越嚴(yán)重,SS水平越低,有些學(xué)者認(rèn)為SS是抑郁癥的一個狀態(tài)標(biāo)志。胃泌素主要由胃竇及十二指腸黏膜的G細(xì)胞分泌,另外人胰島的D細(xì)胞也有分泌,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦、延髓的迷走神經(jīng)背核也含有胃泌素。其生理作用為促進(jìn)胃酸分泌、使胃竇和幽門括約肌收縮,延緩胃排空。本實驗選用慢性“夾尾刺激法”復(fù)制FD模型,從適度的慢性軀體刺激引發(fā)心理應(yīng)激,能較好的模擬FD病人抑郁和消化吸收功能減退等的臨床特點。本研究結(jié)果顯示,在下丘腦,SS定位于神經(jīng)元細(xì)胞的胞膜和(或)胞漿上,而GAS則主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿,在胃竇中,GAS、SS主要表達(dá)在黏膜層上皮細(xì)胞的胞漿中。有研究發(fā)現(xiàn),在人體,多巴胺可能是通過改變肽類激素水平,從而影響消化間期胃腸運動,為此本研究選擇嗎丁啉為對照組,觀察了柴胡疏肝散對FD大鼠下丘腦和胃竇GAS、SS表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),柴胡疏肝散能顯著上調(diào)FD大鼠胃竇GAS蛋白表達(dá),下調(diào)胃竇SS蛋白表達(dá),作用與嗎丁啉相當(dāng),提示柴胡疏肝散與嗎丁啉一樣具有調(diào)節(jié)FD外周胃腸激素分泌紊亂的作用;嗎丁啉對下丘腦的GAS和SS表達(dá)水平均無明顯影響,這可能與其不能透過血腦屏障,在腦中幾乎無分布有關(guān);而柴胡疏肝散還能顯著上調(diào)下丘腦GAS表達(dá),但對下丘腦SS無明顯影響,提示其在中樞水平對部分腦腸肽的作用,也提示其復(fù)方多靶點的整體調(diào)治作用。由此推測疏肝理氣法能使得FD肝氣正常升發(fā),津血能正常為五臟六