hplc-elsd法測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中鈉離子含量及成鹽率

hplc-elsd法測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中鈉離子含量及成鹽率

氨基乙醇鈉（cefticsoud，c18h16n8na2o7s2，又名三羥色胺）是1978年瑞沙羅公司開(kāi)發(fā)的第三代類抗生素。具有光譜強(qiáng)、抗酶性低、半衰期長(zhǎng)（7.9h）、組織透水性強(qiáng)等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用廣泛。國(guó)內(nèi)目前已經(jīng)有幾十家藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道,不同企業(yè)生產(chǎn)的注射用頭孢曲松鈉臨床療效差異,可能是蛋白結(jié)合率差異所致。對(duì)注射用頭孢曲松鈉蛋白結(jié)合率的測(cè)定方法,國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道,有采用分子熒光法、光譜法、毛細(xì)管電泳法(CE)等方法直接測(cè)定,尚未見(jiàn)液相色譜法報(bào)道。當(dāng)頭孢曲松鈉成鹽完全時(shí),鈉原子(Na)與頭孢曲松酸(C18H18N8O7S3)的摩爾比應(yīng)為2:1。在以前研究中已經(jīng)證明,成鹽不完全的頭孢曲松鈉,往往由于含有過(guò)多的游離頭孢曲松酸而導(dǎo)致血漿蛋白結(jié)合率偏高從而使得起效時(shí)間延長(zhǎng)(圖1)。因此可通過(guò)HPLC法測(cè)定頭孢曲松鈉中鈉離子與活性成分的摩爾比,計(jì)算成鹽程度,進(jìn)而推測(cè)成鹽率差異可能引起蛋白結(jié)合率不同的原因之一。目前,測(cè)定藥物活性成分中鈉離子的辦法主要有:原子吸收分光光度法、HPLC-ELSD法、離子色譜法、ICP-MS、CE法等。其中,原子吸收分光光度法樣品前處理步驟多,常常引入系統(tǒng)誤差;離子色譜法需要價(jià)格昂貴的陰(陽(yáng))離子交換色譜柱以及相配套的電導(dǎo)檢測(cè)器、離子抑制器等設(shè)備,難以推廣;ICP-MS前處理步驟多,靈敏度很高,常常受玻璃儀器、實(shí)驗(yàn)用水等殘留鈉離子干擾,導(dǎo)致誤差較大:CE法能同時(shí)實(shí)現(xiàn)陰離子、陽(yáng)離子、中性分子的分離,因具有快速、高效、前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)在小離子分離領(lǐng)域已大量替代了離子色譜法,廣泛用于國(guó)外制藥工業(yè)。近年來(lái),隨著色譜公司新型分離填料的發(fā)展,在分離分析復(fù)雜體系樣品時(shí),單一模式的色譜柱已經(jīng)不能滿足需要,混合模式色譜柱(mixed-modecolumn)應(yīng)運(yùn)而生。根據(jù)文獻(xiàn)資料,美國(guó)DIONEX公司生產(chǎn)的兩性離子交換-反相-親水作用混合模式色譜柱(ZIC-RP-HILIC,zwitterionexchangereversedphase-hydrophilicinteractionmixed-modecolumn),在高比例有機(jī)相條件下具有親水作用模式,可同時(shí)分離酸性、堿性和中性藥物以及各自成鹽離子的混合物,在色譜分離后,采用通用的質(zhì)量型蒸發(fā)光散射檢測(cè)檢測(cè)器(ELSD)進(jìn)行檢測(cè),新建了HPLC-ELSD法,測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中鈉離子含量;同時(shí)采用HPLC-UV法測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中頭孢曲松酸含量,計(jì)算出不同工藝樣品中頭孢曲松鈉的成鹽程度,將其結(jié)果與CE法測(cè)定的蛋白結(jié)合率比較,討論了頭孢曲松成鹽率與蛋白結(jié)合率的相關(guān)性,嘗試用液相色譜法評(píng)價(jià)小分子藥物與體內(nèi)蛋白作用的可行性。1儀器和試劑盒1.1高效液相色譜條件Dionex液相色譜系統(tǒng)(包括P680型雙三元輸液泵,ASI100型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),PDA100型二極管陣列檢測(cè)器,TCC-100型柱溫箱,Chromleon色譜工作站軟件),美國(guó)Dionex公司;島津20A液相色譜系統(tǒng)(包括LC-10AT型雙輸液泵,DGU-12A型在線脫氣機(jī),SIL-10A型自動(dòng)進(jìn)樣器;CTO-10A型柱溫箱;SPD-10A型紫外檢測(cè)器,Alltech蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,數(shù)據(jù)處理軟件為CLASS-VP),日本島津公司,Milli-Q超純水系統(tǒng),法國(guó)Millipore公司。1.2頭孢曲松雜質(zhì)c對(duì)照品,為試劑治理廢水注射用頭孢曲松鈉樣品5批,分別為A廠(09030302);B廠(0905082);C廠(0904244);D廠(20090519),E廠(SH1121),均為2010年國(guó)家監(jiān)督抽驗(yàn)樣品。氯化鈉工作基準(zhǔn)品(NaCl,工作基準(zhǔn)品級(jí)別,含量99.95%~100.05%,以100.0%計(jì),批號(hào):20000318,由北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司提供);頭孢曲松雜質(zhì)C對(duì)照品(2-甲基-3-巰基-1,2-二氫-1,2,4-三嗪-5,6-二酮,俗稱三嗪環(huán),國(guó)家對(duì)照品,含量99.1%,批號(hào):130611-201001,由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供);頭孢曲松對(duì)照品(國(guó)家對(duì)照品,含量84.1%,批號(hào):130480-200302,由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供);醋酸銨(CH3COONH4,AR級(jí)別,含量≥99.5%,批號(hào):20080126,由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供);氯化鉀(KCl,AR級(jí)別,含量≥99.5%,批號(hào)F20100713,由國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供);硫酸鋰(Li2SO4·H2O,AR級(jí)別,含量≥99.0%,批號(hào):20060405,由天津市祿晨化學(xué)試劑廠提供);無(wú)水氯化鈣(CaCl2,AR級(jí)別,含量≥96.05%,批號(hào)F20070731,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供);冰醋酸(CH3COOH,AR級(jí)別,含量≥99.5%,批號(hào):20091020,由北京化工廠提供);乙腈(CH3CN,色譜純,含量≥99.9%,批號(hào):100606,由FisherScientific提供)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備取氯化鈉工作基準(zhǔn)品(含量以100.0%計(jì))適量,置105℃干燥至恒重后,精密稱定76.01mg,置100mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(以鈉離子計(jì),濃度為299.01μg/mL);另精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL,分別置100、50、25、10和5mL量瓶中,用50%乙腈水溶液依次稀釋至刻度,搖勻,分別制成從低濃度到高濃度的系列對(duì)照品溶液(以鈉離子計(jì)濃度分別為2.990、5.980、11.96、29.90、59.80μg/mL)。2.2供試品溶液的制備取供試品細(xì)粉約12.5mg,精密稱定,置25mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,過(guò)濾,取續(xù)濾液作為供試品溶液(濃度為0.5mg/mL)。2.3頭孢曲松鈉的含量測(cè)定色譜條件A:用于測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中活性成分(頭孢曲松酸)含量,與中國(guó)藥典2010年版二部一致。I號(hào)色譜柱為DiamonsilC18(4.6mm×150mm,5μm),S/N8135658;II號(hào)色譜柱為VenusilXBPC18(L)4.6mm×250mmS/N:V9520525BH0021,購(gòu)自天津艾杰爾科技有限公司,柱溫為室溫,流動(dòng)相為0.02mmol/L正辛胺溶液-乙睛(73:27,V/V),用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.5;流速為1.0mL/min;進(jìn)樣器溫度為4℃,進(jìn)樣體積為20μL;紫外檢測(cè)器(200~400nmPDA檢測(cè)器),檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。取頭孢曲松對(duì)照品和頭孢曲松反式異構(gòu)體對(duì)照品各22mg,置100mL量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。頭孢曲松峰和頭孢曲松反式異構(gòu)體峰之間的分離度應(yīng)不小于6.0。此色譜條件源于中國(guó)藥典,不再進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。色譜條件B:用于測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中鈉離子含量。Ⅲ號(hào)色譜柱為混合模式色譜柱AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm),購(gòu)自美國(guó)Dionex公司,LotNo.006-04-062;Ⅳ號(hào)色譜柱也是AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm),購(gòu)自美國(guó)Dionex公司,LotNo.006-04-031;以30mmol/L醋酸銨緩沖鹽(取醋酸銨4.59g,加水1900mL使溶解,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.21,加入乙腈100mL)-乙腈(50:50,V/V)為流動(dòng)相,流速為0.3mL/min;柱溫為25℃;以Alltech蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè),漂移管溫度:90℃,氮?dú)庾鳛檩d氣,流速為5.3kg/cm3。在色譜圖中,鈉離子主峰的保留時(shí)間約6min,鈉離子峰與氯離子峰的分離度應(yīng)大于10。此方法為新建方法,需要方法學(xué)驗(yàn)證。色譜條件C:此色譜條件專用于實(shí)驗(yàn)完成后沖洗頭孢曲松酸,以200mmol/L醋酸銨緩沖鹽(取醋酸銨30.6g,加水1900mL使溶解,用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.83,加入乙腈100mL)為流動(dòng)相,流速、柱溫、檢測(cè)器等其他參數(shù)同色譜條件B,此色譜條件僅用于色譜柱保養(yǎng),不需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。3結(jié)果3.1鈉離子含量測(cè)定中采用的方法因HPLC測(cè)定注射用頭孢曲松鈉中頭孢曲松含量的實(shí)驗(yàn)方法與中國(guó)藥典2010年版的含量測(cè)定結(jié)果一致,不再進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,僅對(duì)HPLC-ELSD法測(cè)定鈉離子含量的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。3.1.1降解頭孢曲松鈉離子峰精密稱定氯化鉀11.75mg、氯化鈉基準(zhǔn)品17.60mg、硫酸鋰12.05mg、碳酸氫鈉10.50mg、無(wú)水氯化鈣29.02mg、頭孢曲松雜質(zhì)C對(duì)照品10.37mg、頭孢曲松對(duì)照品15.05mg,分別置10mL量瓶中,分別用60%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別進(jìn)樣上述各溶液以確定各離子峰位;精密量取上述各溶液1mL,置10mL量瓶中,用60%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻;將上述降解溶液進(jìn)樣,分析記錄色譜圖值至鈉離子峰保留時(shí)間的3倍。結(jié)果顯示:可能存在的其他陽(yáng)離子如Li+、K+、Cl-以及質(zhì)子化三嗪雜環(huán)(頭孢曲松雜質(zhì)C)與鈉離子基線分離(圖2),Ca2+、SO42-、HCO3-在此色譜條件下不洗脫,不干擾鈉離子測(cè)定(表1)。3.1.2色譜條件下,頭孢曲松峰的測(cè)定分別取供試品溶液、氯化鈉對(duì)照品溶液進(jìn)樣,結(jié)果見(jiàn)圖3,鈉離子峰與氯離子峰之間的分離度為18.53,在此色譜條件下,頭孢曲松峰吸附到色譜柱內(nèi),不干擾鈉離子測(cè)定。當(dāng)實(shí)驗(yàn)完成后,用色譜條件C(200mmol/L醋酸銨緩沖鹽)沖洗色譜柱時(shí),才能將吸附在色譜柱內(nèi)的頭孢曲松酸洗脫出(圖4),推測(cè)可能在此情況下頭孢曲松呈二價(jià)離子狀態(tài)并且與填料中離子交換基團(tuán)結(jié)合較強(qiáng)有關(guān)。3.1.3a對(duì)k-l-4-三氫氧降解產(chǎn)物25和3.2.取供試品溶液5份,每份各5mL,分別進(jìn)行(a)熱降解(110℃加熱1h)、(b)堿破壞(加0.1mol/L氨溶液1mL,室溫放置10min,用0.1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0);(c)氧化降解(加30%過(guò)氧化氫溶液0.1mL,室溫放置1h);(d)酸破壞(加0.1mol/L鹽酸溶液1mL,室溫放置10min,調(diào)節(jié)pH值至7.0);(e)光照降解(紫外燈照射24h后),將上述降解溶液進(jìn)樣,分析記錄色譜圖值至鈉離子峰保留時(shí)間的3倍,結(jié)果各破壞條件下的降解產(chǎn)物均與鈉離子峰分離良好(圖5)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,頭孢曲松主峰不干擾鈉離子峰的測(cè)定,頭孢曲松在熱、堿、氧化、酸、紫外光照條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰與鈉離子分離良好,從而證實(shí)了方法的專屬性好;3.2鈉離子進(jìn)樣濃度計(jì)算分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液(即含相當(dāng)于鈉離子2.990,5.980,11.96,29.90,59.80μg/mL)從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣,進(jìn)樣體積為20μL,記錄色譜峰面積,以鈉離子濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得出二階多項(xiàng)式回歸方程以及范圍,結(jié)果表明鈉離子進(jìn)樣濃度在2.990~59.80μg/mL范圍內(nèi)呈二項(xiàng)式相關(guān)關(guān)系。3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法精密量取對(duì)照品溶液2.990μg/mL0.5mL置100mL容量瓶中,加60%乙腈水溶液稀釋至刻度,搖勻,用0.45μm濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液按上述色譜條件進(jìn)樣20μL,信噪比約為10:1,定量限為1.97μg/mL;檢測(cè)限為0.65μg/mL。3.4精密度3.4.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣穩(wěn)定性測(cè)定取“2.4”項(xiàng)下濃度為11.96μg/mL的對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄鈉離子峰的保留時(shí)間和峰面積,RSD(n=6)分別為0.52%和0.48%。3.4.2鈉離子含量測(cè)定取注射用頭孢曲松鈉樣品E廠(批號(hào)為SH1121)約12.5mg,精密稱定,分別按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,由不同實(shí)驗(yàn)室、不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)人重復(fù)測(cè)定,進(jìn)樣20μL,記錄鈉離子峰面積,計(jì)算鈉離子平均含量為7.41%,RSD(n=6)為4.32%。3.4.3溶液配制取注射用頭孢曲松鈉樣品E廠(批號(hào)為SH1121)約12.5mg,精密稱定,分別按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,進(jìn)樣20μL,記錄鈉離子峰面積,平均值為7.39%,RSD(n=6)為6.47%。3.5溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取注射用頭孢曲松鈉樣品E廠(批號(hào)為SH1121)約12.5mg,精密稱定,分別按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,室溫靜置,在上述條件下于0,4,8,12,16和24h依法進(jìn)樣20μL,記錄鈉離子峰面積RSD為4.99%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。3.6價(jià)格精度3.6.1加樣回收率試驗(yàn)采用加樣回收率試驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度測(cè)定。取注射用頭孢曲松鈉樣品E廠(批號(hào)為SH1121)約12.5mg,精密稱定,分別精密加入鈉離子濃度為394.01μg/mL的對(duì)照品溶液1.0,2.0和5.0mL,分別相當(dāng)于加入鈉離子0.343,0.686和1.714mmol/mL)分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每個(gè)濃度平行操作3次,依法測(cè)定,計(jì)算回收率,平均回收率分別為110.0%、104.1%、107.1%,RSD分別為9.0%、1.7%、4.6%(n=3)。3.6.2方法回歸率將同批次樣品用原子吸收分光光度法測(cè)定結(jié)果,以2個(gè)方法測(cè)定結(jié)果的比值作為回收率,以評(píng)價(jià)新建HPLC-ELSD法的準(zhǔn)確度。3.7gc-ms色譜條件選擇由2個(gè)實(shí)驗(yàn)者在不同天用Waters2695型液相色譜儀(A)以及DionexP680液相色譜儀(B),分別用Ⅲ號(hào)和Ⅳ號(hào)色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn),均得到了類似的HPLC色譜圖,鈉離子峰和氯離子峰分離良好,峰形正常,顯示方法具有比較充分的色譜耐用性。3.8計(jì)算成鹽率的確定按“2.2”項(xiàng)下方法,每個(gè)樣品平行制備兩份供試品溶液。在上述色譜條件下,分別精密量取對(duì)照品溶液(以鈉離子計(jì)濃度分別為2.990,5.980,11.96,29.90和59.80μg/mL)與供試品溶液各20μL進(jìn)樣,記錄鈉離子峰面積,按二階多項(xiàng)式回歸方程計(jì)算供試品溶液中含鈉離子的量,結(jié)果見(jiàn)表2及圖1,以下式計(jì)算成鹽率:成鹽率計(jì)算公式:%=(鈉離子%/22.99)/(頭孢曲松酸%/554.59)4色譜柱的檢測(cè)方法混合模式色譜柱(mixed-modecolumn)是將不同的填料和官能團(tuán)雜交在一根色譜柱上,應(yīng)用不同的分離機(jī)理,同時(shí)分離性質(zhì)差異較大的化合物。目前,混合模式色譜柱主要包括:反相/陰離子交換色譜柱、反相/陽(yáng)離子交換色譜柱、反相/親水作用色譜柱、兩性離子交換色譜柱、陰(陽(yáng))離子交換/親手性色譜柱、陽(yáng)離子交換/手性色譜柱、兩性離子交換/親水性色譜柱和兩性離子交換/反相色譜柱/親水作用色譜柱等。本文所選擇的色譜柱AcclaimTrinityP1(3.0mm×100mm,5μm)屬于兩性離子交換-反相-親水作用混合模式色譜柱,是在硅膠顆粒內(nèi)孔表面用有機(jī)層修飾,鍵合烷基鏈和強(qiáng)陰離子交換基團(tuán),而在硅膠顆粒外表面鍵合烷基碳鏈和弱陽(yáng)離子交換基團(tuán)。由于同時(shí)存在烷基碳鏈基團(tuán)、陰離子以及陽(yáng)離子交換基團(tuán)的存在,該色譜柱具有離子交換和反相雙重作用模式,在高比例有機(jī)相條件下具有親水作用模式,可同時(shí)分離酸性、堿性和中性藥物以及各自成鹽離子的混合物。由此可以看出,在色譜分離后,應(yīng)采用通用性強(qiáng)的檢測(cè)器予以測(cè)定,才能最大程度地發(fā)揮此類型色譜柱的優(yōu)勢(shì)。目前在國(guó)外研究中,有報(bào)道采用Corona?CAD檢測(cè)器,CAD檢測(cè)器為最新開(kāi)發(fā)出來(lái)的檢測(cè)器,具有靈敏度高、通用性好等特點(diǎn),但價(jià)格昂貴、維護(hù)成本高;而蒸發(fā)光散射檢測(cè)檢測(cè)器(ELSD)也是通用性好的質(zhì)量型檢測(cè)器,因此,本文擬考慮建立通用性很廣的分析方法,用于測(cè)定化學(xué)藥物活性成分中成鹽離子的含量,例如Na+、K+、Ca2+、NH4+、Cl-、Br-等的測(cè)定,同時(shí)通過(guò)計(jì)算成鹽率以監(jiān)測(cè)藥物活