2022分子體外診斷檢驗(yàn) 唾液檢驗(yàn)前過程的規(guī)范提取人類 DNA

分子體外診斷試驗(yàn)唾液檢驗(yàn)前過程的規(guī)范提取人類DNAII目 次前言 II引言 III范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1總則 3實(shí)驗(yàn)室外部 4標(biāo)本采集 4轉(zhuǎn)運(yùn)要求 6實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部 6標(biāo)本準(zhǔn)備 6貯存要求 6唾液DNA的分離 7DNA的定性和定量評估 7DNA的儲存 8參考文獻(xiàn) 9IIIIII引 言DNA唾液越來越多地作為一種替代血液的非侵入性標(biāo)本來檢測人類DNA。唾液含有微生物和外來物質(zhì)（例如食物殘?jiān)?體外診斷制造商在進(jìn)行驗(yàn)證和確認(rèn)設(shè)計(jì)時(shí)，也需要注意標(biāo)本的可變性。唾液中的DNA可能會片段化或降解。此外，唾液標(biāo)本中的細(xì)菌也能繼續(xù)生長繼而稀釋人類的DNA。這些細(xì)菌分泌的脫氧核糖核酸酶也能加速DNA降解。這些都會可能影響DNA檢測的靈敏度和可靠性。從標(biāo)本采集到DNADNA降解和唾液采集后的片段化等檢測前因素的影響。本文件包含為獲得高質(zhì)量的唾液標(biāo)本/樣品和從中分離出用于人類DNA檢測而需要采取的特殊措施。PAGEPAGE1分子體外診斷試驗(yàn)唾液檢驗(yàn)前過程的規(guī)范提取人類DNA范圍DNA檢驗(yàn)的唾液標(biāo)本的要求和建議。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB19781-2005醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室-安全要求（ISO15190:2003,IDT）GB/T22576.1-2018醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求（ISO15189:2012,IDT）WS/T806-2022臨床血液與體液檢驗(yàn)基本技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)WS/T442-2014臨床實(shí)驗(yàn)室生物安全指南WS/T514-2017臨床檢驗(yàn)方法檢出能力的確認(rèn)和驗(yàn)證術(shù)語和定義GB/T22576.1界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。環(huán)境溫度ambienttemperature未經(jīng)調(diào)節(jié)的周圍空氣的溫度。分析物analyte被測量名稱所代表的組分。[來源：GB/T21415-2008,3.2，有修改]檢驗(yàn)性能examinationperformance測試待測分析物檢驗(yàn)的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度。注：也包含其他測試性能特性，比如穩(wěn)健性、重復(fù)性等。DNA穩(wěn)定劑DNAstabilizers指能盡量減少DNA降解和碎裂的化合物、溶液或混合物。封閉系統(tǒng)closedsystem供應(yīng)商提供的不可改變的系統(tǒng)，包括分析所需的所有組成部分（即硬件、軟件、程序和試劑）。DNA以雙鏈或單鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸聚合體。檢驗(yàn)examination以確定一個(gè)特性的值或特征為目標(biāo)的一組操作。注：從分離的分析物開始并包括各種用于定性或定量檢驗(yàn)的參數(shù)測試或化學(xué)操作的過程。檢驗(yàn)提供者examinationprovider提供特定分析測試的實(shí)體。干擾物質(zhì)interferingsubstance能存在于標(biāo)本中的可能改變檢驗(yàn)結(jié)果的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)（例如穩(wěn)定劑）。微生物microorganism包括細(xì)菌、真菌和原生動物。檢驗(yàn)前過程pre-examinationprocess分析前階段/檢驗(yàn)前工作流程：按時(shí)間順序從臨床醫(yī)生的申請開始，包括檢驗(yàn)申請、患者的準(zhǔn)備和注：檢驗(yàn)前階段包括影響預(yù)期檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)備流程。原始樣品primarysample為檢驗(yàn)、研究或分析一種或多種量或特性而取出的認(rèn)為可代表全部的一獨(dú)立部分的體液、呼出氣、頭發(fā)或組織。能力驗(yàn)證proficiencytesting利用實(shí)驗(yàn)室間比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價(jià)參加者的能力。室內(nèi)溫度roomtemperature本文件中是指18℃-25℃注：地方或國家法規(guī)可能存在不同定義。唾液saliva唾液是一種生物液體，主要由三大唾液腺（腮腺、頜下腺和舌下腺）和口腔內(nèi)的唾液腺分泌物組成。唾液采集器salivacollectiondevice用于采集唾液標(biāo)本的試管或其他容器。樣品sample取自原始樣品的一部分或多部分。穩(wěn)定性stability標(biāo)本/樣品在特定儲存條件下，在特定時(shí)間內(nèi)保持特定屬性值的能力。注：本文件涉及的分析物是所分離的DNA。貯存storage在適宜的條件下長時(shí)間中斷樣品、分析物或其衍生物（如染色切片或組織塊）的分析前工作流程，以保持其特性。注：通常在實(shí)驗(yàn)室檔案庫或生物樣本庫中進(jìn)行長時(shí)間貯存。確認(rèn)validation通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)用要求已得到滿足的認(rèn)定。驗(yàn)證verification通過提供客觀證據(jù)確認(rèn)特定要求已得到滿足。注1：“已驗(yàn)證”一詞用于表明相應(yīng)的狀態(tài)。注2：認(rèn)定可能包括以下活動：進(jìn)行替代計(jì)算；比較新的設(shè)計(jì)規(guī)格與相似的已核實(shí)設(shè)計(jì)規(guī)格；進(jìn)行測試和示范；以及在簽發(fā)前審查文件。工作流程workflow完成一項(xiàng)工作所需活動的結(jié)構(gòu)化順序。總則（包括避免交叉污染B/T256.1或SOIC700。有關(guān)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、試劑和消耗品的要求應(yīng)遵循B/T2761和SOIC020O/S06820387。診斷工作流程的所有步驟都可能影響最終的檢驗(yàn)結(jié)果。因此，包括生物分子穩(wěn)定性、標(biāo)本/樣品貯DNA的穩(wěn)定性。性能的驗(yàn)證以及預(yù)期檢驗(yàn)的確認(rèn)應(yīng)考慮到唾液標(biāo)本質(zhì)量的可變性。設(shè)計(jì)和開發(fā)唾液DNA實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估（另見ISO14971）。如有需要，應(yīng)制定消除或減少已確定風(fēng)險(xiǎn)的措施，以確保檢驗(yàn)工作的順利進(jìn)行。這部分內(nèi)容應(yīng)包括審核檢驗(yàn)前的工作流程步驟。在設(shè)計(jì)檢驗(yàn)之前或期間，宜確保檢驗(yàn)所需的最低DNA含量、大小及純度等人類DNA質(zhì)量參數(shù)，確保其不會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。關(guān)于標(biāo)本運(yùn)送和處理的安全說明應(yīng)參見GB/T22576.1和GB19781相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。在整個(gè)檢驗(yàn)前過程中，應(yīng)采取預(yù)防措施避免不同標(biāo)本/樣品之間的交叉污染，例如：處理不同的標(biāo)本/樣品時(shí)，使用一次性的材料（可行時(shí)），或是采用適當(dāng)?shù)那逑闯绦?。所有檢驗(yàn)前步驟，應(yīng)遵循廠家的說明書（如果有）。（例如未能滿足患者的需要在首次使用任何有潛在危險(xiǎn)的物料（例如穩(wěn)定劑中的化學(xué)品）前，宜詳細(xì)閱讀廠家的物料安全資料表。實(shí)驗(yàn)室外部標(biāo)本采集標(biāo)本供體/患者信息應(yīng)包括標(biāo)本供體/患者的ID，能用編碼的形式。應(yīng)包括但不局限于：a)標(biāo)本供體/患者的相關(guān)健康狀況，例如健康狀況、疾病類型、伴隨疾病、人口統(tǒng)計(jì)信息（如性別、年齡）；b)采集唾液前的常規(guī)醫(yī)學(xué)治療和特殊治療信息，例如麻醉劑、藥物治療；c)所要求的檢查類型和目的；d)標(biāo)本供體/患者的相應(yīng)的知情同意。實(shí)驗(yàn)室對唾液采集裝置的選擇（例如由于以往法律要求較松），實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定、驗(yàn)證、確認(rèn)及記錄唾液采集裝置。不規(guī)范的唾液采集程序、不適當(dāng)?shù)膬Υ?運(yùn)送條件和DNA分離程序均可能影響人類DNADNA降解和碎片5.1.4.3患者唾液樣本的采集和穩(wěn)定概述應(yīng)制定唾液樣本采集方案。唾液標(biāo)本采集前，應(yīng)向標(biāo)本供體/患者提供來自制造商、實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)生的書面說明資料。用戶說明宜應(yīng)包含唾液標(biāo)本采集的要求和說明。如果沒有的話（例如由于以往法律要求較寬松），應(yīng)對唾液采集過程進(jìn)行核實(shí)和記錄。采集標(biāo)本的程序應(yīng)包括：唾液標(biāo)本采集、鑒定、儲存及運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的全過程；采集標(biāo)本前須遵循的規(guī)定，特別是與營養(yǎng)、口腔衛(wèi)生有關(guān)的要求，例如在采集樣本前禁食；采集標(biāo)本時(shí)避免混有咳嗽/咳痰或鼻分泌物（打噴嚏）所產(chǎn)生的黏液。為方便自行采集，樣品患者應(yīng)配備合適的唾液采集裝置、身份識別標(biāo)簽（例如標(biāo)簽、射頻識別（RFID）），以及其他用于采集、貯存及運(yùn)送標(biāo)本的所需物品。此外，應(yīng)為標(biāo)本供體/患者提供電子的或紙質(zhì)版的唾液標(biāo)本采集的詳細(xì)步驟。采集標(biāo)本的人能以編碼代稱，根據(jù)GB/T22576.1的要求，應(yīng)記錄采集唾液的時(shí)間和日期。（樣本/標(biāo)本識別GB/T22576.1（例如二維碼。唾液采集裝置應(yīng)遵循操作說明，特別是：所需的唾液量；采集唾液后立即搖晃或倒置，使唾液與穩(wěn)定劑混合。注：如果唾液采集裝置中的添加劑與標(biāo)本沒有均勻混合，那么可能會影響唾液DNA的質(zhì)量和數(shù)量，從而可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的有效性和可靠性。應(yīng)記錄所有對唾液標(biāo)本的處理過程。標(biāo)本供體/患者或從標(biāo)本供體/患者處采集唾液標(biāo)本的人應(yīng)確認(rèn)與提供的唾液標(biāo)本采集說明一致。DNA用戶宜應(yīng)提交經(jīng)過核實(shí)的唾液標(biāo)本采集說明書（例如特定的采集裝置、加入穩(wěn)定劑的樣本等）。（例如由于以前的法律要求較寬松有關(guān)程序需應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行指定、/標(biāo)本供體采集標(biāo)本前的準(zhǔn)備，例如在唾液標(biāo)本采集前至少30分鐘不要吃、喝、吸煙、親吻或咀嚼任何物質(zhì)。注：使用帶穩(wěn)定劑的采集裝置采集的標(biāo)本可以適應(yīng)較長時(shí)間的運(yùn)輸和儲存。DNA如果用戶允許使用不含穩(wěn)定劑的唾液采集裝置，則應(yīng)為唾液采集提供指定的經(jīng)驗(yàn)證過的采集說明。如果用戶沒有提供這些說明（例如由于以前的法律要求不那么嚴(yán)格），有關(guān)程序應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行指定、核實(shí)和記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為使用者提供相應(yīng)的可行的說明。這些說明宜應(yīng)包括標(biāo)本供體/患者采集標(biāo)本前的準(zhǔn)備工作，例如在唾液標(biāo)本采集前至少30分鐘不能吃、喝、吸煙、親吻或咀嚼任何食物。標(biāo)本的儲存要求概述對于計(jì)劃在生物樣本庫中長期儲存的標(biāo)本，通常不知道后續(xù)會進(jìn)行哪項(xiàng)DNA檢驗(yàn)，因此，為盡量保存DNADNADNA條例在儲存前對DNA的質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行評估。如果是自行采集，用戶、實(shí)驗(yàn)室或醫(yī)生應(yīng)向標(biāo)本供體/患者提供書面的唾液標(biāo)本存儲說明。標(biāo)本供體/患者或從標(biāo)本供體/患者處采集唾液樣本的人員應(yīng)確認(rèn)標(biāo)本是否符合儲存要求。總儲存時(shí)間包含上述所述的唾液標(biāo)本在采集裝置中臨時(shí)儲存的時(shí)間。制定唾液標(biāo)本采集的通用規(guī)范。DNA用戶宜應(yīng)提供經(jīng)過驗(yàn)證的關(guān)于采集的唾液標(biāo)本的儲存和運(yùn)送要求（例如持續(xù)時(shí)間、溫度）。（例如由于以前的法律要求不那么嚴(yán)格有關(guān)程序應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行指DNA（（例如由于以前的法律要求不那么嚴(yán)格有即冷凍，在≤-20℃下可儲存3個(gè)月，在≤-80℃下可長期儲存。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)核實(shí)最長的儲存時(shí)間，并按其最短時(shí)間進(jìn)行儲存。不建議在實(shí)驗(yàn)室外使用不含DNA穩(wěn)定劑的采集裝置進(jìn)行自我采集，貯存條件應(yīng)記錄在案（即貯存時(shí)間及溫度）。轉(zhuǎn)運(yùn)要求概述用戶需應(yīng)為采集的唾液標(biāo)本提供經(jīng)過驗(yàn)證的可行的運(yùn)輸條件（例如持續(xù)時(shí)間、溫度）。（例如由于以前的法律要求不那么嚴(yán)格有關(guān)程序應(yīng)由實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行指定、核實(shí)和記錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)為使用者提供相應(yīng)的可行的說明。（例如溫度記錄器進(jìn)行溫度監(jiān)控和記錄。如果無法進(jìn)行記錄，則宜估計(jì)并記錄周圍環(huán)境溫度。參見GB/T22576.1相關(guān)條例。DNA如果使用含DNA（即持續(xù)時(shí)間和溫度進(jìn)行（即持續(xù)時(shí)間及溫度）。DNA如果使用不含DNA穩(wěn)定劑的唾液采集裝置，同樣應(yīng)記錄運(yùn)送條件（即持續(xù)時(shí)間及溫度）。如果使用不含DNA5.1.4.320DNA（即持續(xù)時(shí)間及溫度）。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部標(biāo)本準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室應(yīng)記錄唾液標(biāo)本//患者或曾向標(biāo)本供體/患者采集唾液標(biāo)本的人士的合格確認(rèn)書。與既定運(yùn)送程序規(guī)程的任何偏離都應(yīng)進(jìn)行記錄，如不符合規(guī)格的標(biāo)簽和運(yùn)輸條件、唾液標(biāo)本體積不足或過量、滲漏/破損、變色器具、不適當(dāng)?shù)牟少A存要求（（例如由于以前的法律要求較寬松5.1.4和5.2相關(guān)規(guī)定。唾液標(biāo)本的總儲存時(shí)間應(yīng)包括在唾液采集地點(diǎn)的時(shí)間（見5.1.4）、運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室的運(yùn)輸時(shí)間（見5.2）DNA用戶應(yīng)為唾液DNA的提取提供經(jīng)過驗(yàn)證的可行程序。為避免DNADNA分離與檢測過程的擴(kuò)增步驟不應(yīng)在相同地方進(jìn)行。如果開發(fā)自動化的DNA分離程序，則應(yīng)采取措施以避免標(biāo)本/樣品之間的交叉污染。用戶所選用的DNA提取程序提取的DNA（例如DNA的質(zhì)量和數(shù)量、DNA濃度、DNA長度）。由于唾液標(biāo)本含有微生物、病毒和食物殘?jiān)?，所以分離出來的人類DNA通常會含有微生物DNA和少量來自食物的其他生物DNA。由于唾液標(biāo)本中的微生物和病毒含量可能在樣本供體/患者之間具有很大的變異性，所以微生物DNA污染的程度也不同，這可能影響人類DNA的定量。一些研究顯示，從含有穩(wěn)定劑的特定采集管采集的每毫升唾液中，總DNA產(chǎn)量（不分人類和非人類DNA）介于0.1微克和26微克之間。在含有穩(wěn)定劑的特定采集管內(nèi)采集的標(biāo)本，微生物含量中位數(shù)低于漱口水和口腔拭子樣本。與DNA接觸的試劑和消耗品宜是無DNA的。DNA提取性能宜在DNA能力驗(yàn)證中進(jìn)行檢測。使用商品化試劑盒如果用戶要求使用市面上某種專用的DNA分離試劑盒，則應(yīng)嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。如果用戶沒有明確要求（例如由于以往較寬松的法律要求），但唾液采集裝置制造商已推薦某一DNA分離試劑盒，實(shí)驗(yàn)室能推薦使用此試劑盒。如果兩者都沒有指定專用的DNA分離試劑盒，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇使用有批文的合適的DNA分離試劑盒。如果可能的話，選擇指定標(biāo)本/樣品為唾液的DNA分離試劑盒。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)驗(yàn)證所選試劑盒是否合適。使用實(shí)驗(yàn)室自建的程序如果所有的商用DNA——以唾液為提取標(biāo)本/樣品修改現(xiàn)有的DNA分離試劑盒提取程序；——使用市售的只用于研究的DNA分離試劑盒；——建立自己的規(guī)程。經(jīng)上述程序選擇并確認(rèn)的DNA分離程序，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)給出可按照執(zhí)行的具體使用說明。注1：不同的DNA分離程序獲得的DNA片段長度可能不一。此外，DNA數(shù)量和質(zhì)量（例如純度）可能也會有所不同。注2：采用離心、酶或化學(xué)液化等方法對粘性標(biāo)本/樣品進(jìn)行預(yù)處理，能使樣品均勻化，提高核酸的提取效率。注3：穩(wěn)定分子可能會干擾實(shí)驗(yàn)，因此在DNA提取過程種，需要專門的步驟避免DNA穩(wěn)定分子的污染。DNADNA（根據(jù)具體的檢驗(yàn)測試做選擇）：通過檢測吸光度（A260）或熒光光譜測定量；注：唾液標(biāo)本的核酸可能含有大量微生物、病毒和食物殘?jiān)腄NA。這些共同構(gòu)成了唾液核酸的總量。因此只能使用特定的實(shí)驗(yàn)（d）對人類的DNA進(jìn)行定量。通過測量吸光度檢測純度（如：波長掃描、計(jì)算A260/A280的比值）；DNA（3’/5’分析或差異長度擴(kuò)增子比率）；DNA