基因工程原理與技術(shù)（第四版）課件 第11、12章 重組DNA技術(shù)的應(yīng)用、基因敲除技術(shù)

第十一章重組DNA技術(shù)的應(yīng)用第一節(jié)DNA與疾病診斷一、基因診斷的含義基因診斷（genediagnosis）是基于基因與疾病的相互關(guān)系，利用現(xiàn)代生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接從DNA水平上來探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常，從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。二、基因診斷的原理及特點(diǎn)

（一）基因診斷的原理（二）基因診斷的特點(diǎn)與傳統(tǒng)的診斷方法比較，基因診斷有以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）以探測基因?yàn)槟繕?biāo)，屬于“病因診斷”，針對(duì)性強(qiáng)、特異性高；（2）由于檢測技術(shù)十分敏感，故診斷靈敏度相當(dāng)高；（3）由于基因探針或引物可為任何來源，任何種類，所以適應(yīng)性強(qiáng)，診斷范圍廣；（4）在感染性疾病的基因診斷中，不僅可檢出正在生長的病原體，也能檢出潛伏的病原體；既能確定既往感染，也能確定現(xiàn)行感染；既能診斷普通菌株或病毒，也能檢出變異株；同時(shí)，能對(duì)那些不容易體外培養(yǎng)（如產(chǎn)毒性大腸桿菌）和不能在實(shí)驗(yàn)室安全培養(yǎng)（如立克次體）的病原體作出診斷，所以大大擴(kuò)大了診斷范圍。三、基因診斷的方法以核酸分子雜交、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和序列分析為基礎(chǔ),建立了多種多樣的檢測方法。1DNA診斷常用檢測致病基因結(jié)構(gòu)異常的DNA診斷方法有下列幾種：⑴斑點(diǎn)雜交：DNA樣品的溶液被點(diǎn)在濾膜上，變性、中和、干燥固定等。標(biāo)記的探針直接和濾膜上的核酸雜交，再用放射自顯影或其他方法檢測雜交結(jié)果。⑵等位基因特異的寡核苷酸探針（Allele-specificOligonucleotideProbe，ASOProbe）雜交：根據(jù)點(diǎn)突變位點(diǎn)上下游核苷酸序列，合成約15-20個(gè)左右的寡核苷酸片段，其中包含發(fā)生突變的堿基，經(jīng)放射性核素或地高辛標(biāo)記后作為探針，在嚴(yán)格雜交條件下，只有該點(diǎn)突變的DNA樣本，才出現(xiàn)雜交點(diǎn)，即使只有一個(gè)堿基不配對(duì)，也不可能形成雜交點(diǎn)。

⑶單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）：是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別的點(diǎn)突變檢測方法。⑷限制性內(nèi)切酶圖譜（restrictionmap）：如果DNA突變后改變了某一核酸限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，使原來某一識(shí)別位點(diǎn)消失，或形成了新的識(shí)別位點(diǎn)，那么相應(yīng)限制性內(nèi)切酶片段的長度和數(shù)目會(huì)發(fā)生改變。

⑸限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）：遺傳連鎖分析生物個(gè)體間DNA的序列存在差異，據(jù)估計(jì)每100-200個(gè)核苷酸中便有1個(gè)發(fā)生突變，這種現(xiàn)象稱為DNA多態(tài)性。

（6）基因芯片法（microarray）：又稱為DNA微探針陣列。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標(biāo)記的若干靶核酸序列互補(bǔ)匹配，與芯片特定位點(diǎn)上的探針雜交，利用基因芯片雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。

（7）DNA序列分析對(duì)致病有關(guān)的DNA片段進(jìn)行序列測定，是診斷基因異常（已知和未知）最直接和準(zhǔn)確的方法。

2.RNA診斷RNA診斷是以mRNA為檢測對(duì)象，通過對(duì)待測基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析，確定其剪接、加工的缺陷及外顯子的變異，以判斷基因轉(zhuǎn)錄效率的高低，以及轉(zhuǎn)錄物的大小及正常與否，從而對(duì)疾病做出診斷。

（1）RNA印跡（northernblotting）RNA印跡是檢測基因是否表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物mRNA的大小的可靠方法，根據(jù)雜交條帶的強(qiáng)度，可以判斷基因表達(dá)的效率。

（2）RT-PCR是一種檢測基因表達(dá)產(chǎn)物mRNA靈敏的方法，若與熒光定量PCR結(jié)合可對(duì)RT-PCR產(chǎn)物量進(jìn)行準(zhǔn)確測定。（3）mRNA差異顯示PCR技術(shù)（DDRT-PCR）：是在轉(zhuǎn)錄水平上研究基因表達(dá)差異的有效方法。該技術(shù)在分析基因表達(dá)差異、繪制遺傳圖譜、分離特異性表達(dá)基因和臨床診斷遺傳疾病等方面具有特殊的優(yōu)勢，因此一經(jīng)建立就被廣泛應(yīng)用,并取得了可喜的成果。

四、基因診斷的應(yīng)用（一）感染性疾病目前，商品化的診斷試劑盒，已經(jīng)在病毒、細(xì)菌、支原體、衣原體、立克次體及寄生蟲感染診斷中得到了廣泛應(yīng)用。基因診斷還可檢出病毒變異或因機(jī)體免疫狀態(tài)異常等原因不能測出相應(yīng)抗原和抗體的病毒感染。1病原體診斷

（1）病毒性感染多種病毒性感染都可采用基因診斷檢測相應(yīng)的病原體，基因診斷則可直接檢測病毒本身，具有高度敏感，快速準(zhǔn)確等獨(dú)特的優(yōu)越性。（2）細(xì)菌性感染可應(yīng)用基因診斷檢測多種致病性的細(xì)菌，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷依賴痰涂片鏡檢和結(jié)核桿菌的培養(yǎng)與鑒定，但陽性率不高，所需時(shí)間長。目前應(yīng)用PCR技術(shù)建立診斷方法，敏感度可達(dá)到少至100個(gè)細(xì)菌的水平，通過拷貝存在的特異性重復(fù)序列引物，既使菌株發(fā)生變異，也能準(zhǔn)確檢出。2治療過程中的檢測（1）療效監(jiān)測：以PCR和基因芯片為主的核酸分析技術(shù)能對(duì)核酸進(jìn)行定量檢測和變異分析，是療效觀察最好的檢測手段。（2）藥物基因組學(xué)：每個(gè)人由于遺傳背景的不同，對(duì)藥物的利用、代謝及敏感性均有差異，采用基因芯片檢測病人的相關(guān)基因信息，對(duì)臨床用藥提供最佳依據(jù)?？傊蛟\斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用已越來越被人們所認(rèn)識(shí)，它在進(jìn)行傳染病疫情監(jiān)測病原體診斷、治療藥物選擇和療效檢測等方面具有十分重要的作用，必將為傳染病的防控和診治做出重大貢獻(xiàn)。（二）遺傳疾病依據(jù)造成遺傳性疾病的原因又可以將其區(qū)分成：單一基因缺陷的遺傳疾病、染色體變異所引起的遺傳疾病及由多重基因共同影響所造成的遺傳疾病及線粒體基因的變異所引起的疾病。（三）惡性腫瘤

從根本上說，癌癥是細(xì)胞水平上的一種遺傳性紊亂，是一種基因性疾病。從正常細(xì)胞發(fā)展成癌細(xì)胞，一個(gè)基本的變化是細(xì)胞的生長失去控制。相對(duì)于感染性疾病及單基因遺傳病來說，腫瘤的基因診斷難度更大得多。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展從根本上離不開基因的變化，所以基因診斷在腫瘤疾病中也會(huì)有廣闊的前景。其重要表現(xiàn)有以下幾方面：（1）腫瘤的早期診斷及鑒別診斷；（2）腫瘤的分級(jí)、分期及預(yù)后的判斷；（3）微小病灶、轉(zhuǎn)移灶及血中殘留癌細(xì)胞的識(shí)別檢測；（4）腫瘤治療效果的評(píng)價(jià)。五、問題及展望隨著后基因組學(xué)的不斷深入和分子診斷技術(shù)的不斷更新，尤其是臨床醫(yī)學(xué)各學(xué)科與分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和儀器分析學(xué)等其他學(xué)科不斷交叉和互相滲透，人們對(duì)生物大分子和疾病關(guān)系的理解也會(huì)越來越深入，分子診斷將在對(duì)疾病的診斷、預(yù)防和治療方面發(fā)揮日益重要的作用，極大地推動(dòng)現(xiàn)代臨床診斷醫(yī)學(xué)的發(fā)展。一、 基因治療的概念及內(nèi)容（一）基因治療的定義：是用正常基因取代病人細(xì)胞中的缺陷基因，以達(dá)到治療分子病的目的。根據(jù)病變基因所處的細(xì)胞類型，基因治療可分為兩種形式，一種是改變體細(xì)胞的基因表達(dá)，即體細(xì)胞基因治療（somaticgenetherapy）；另一種是改變生殖細(xì)胞的基因表達(dá)，即種系基因治療（germlinegenetherapy）。第二節(jié)疾病的基因治療（二）基因治療的基本內(nèi)容基因治療包括基因診斷、基因分離、載體構(gòu)建以及基因轉(zhuǎn)移四項(xiàng)基本內(nèi)容。

基因分離是指利用DNA重組技術(shù)克隆、鑒定、擴(kuò)增、純化用于治療的基因，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列(即同源序列)和基因表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行體外重組操作。載體構(gòu)建指將上述治療用的基因安裝在合適的載體上。基因轉(zhuǎn)移有兩種方式，一種是體外導(dǎo)入（exvivo）,即在體外將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，再將這種基因修飾過的細(xì)胞回輸病人體內(nèi)，使這種帶有外源基因的細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)，從而達(dá)到治療或預(yù)防的目的。另一種是體內(nèi)導(dǎo)入（invivo），即將外源基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。二、基因治療的分子機(jī)制用于基因治療的基因根據(jù)其功能及作用可分為以下四類。（1）基因矯正（genecorrection）和基因置換（genereplacement），即將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對(duì)缺陷基因精確地原位修復(fù)，不涉及基因組的其他任何改變。（2）基因增強(qiáng)（geneaugmentation），不去除異常基因，而通過導(dǎo)入外源基因使其表達(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因等的功能；（3）基因失活（geneinactivation），有些基因異常過度表達(dá)，如癌基因或病毒基因可導(dǎo)致疾病，可用反義核酸技術(shù)、核酶或誘餌（decoy）轉(zhuǎn)錄因子來封閉或消除這些有害基因的表達(dá)。（4）自殺基因（suicidegene），有些酶在動(dòng)物體內(nèi)是不存在的。如果將它們轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞，再輔以原代謝物或藥物，就能殺滅癌細(xì)胞。因此這類酶稱為自殺酶，相應(yīng)的基因則為自殺基因。

三、載體系統(tǒng)基因?qū)胼d體系統(tǒng)是基因治療的關(guān)鍵技術(shù)，可分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。四、基因治療的策略與方法1.基因治療的靶組織肌肉、心肌、血管、肝、腦、皮膚、呼吸道、黏膜、腫瘤等組織均可作為基因治療的靶組織。2.基因治療的策略分子生物學(xué)的飛速發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的完成，使人們能夠正確了解人類基因組的結(jié)構(gòu)和功能，認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生的分子機(jī)制，這將為開展疾病的基因治療奠定基礎(chǔ)。基因治療的基本策略有以下幾種。（1）基因置換基因置換就是把正常的外源基因?qū)肷矬w靶細(xì)胞內(nèi)，對(duì)致病基因進(jìn)行原位重組置換，以恢復(fù)基因的原有正常功能，從而達(dá)到治療的目的。（2）基因矯正基因矯正是指原位修復(fù)致病基因的點(diǎn)突變，以恢復(fù)原有基因的功能，而不一定改變致病基因的結(jié)構(gòu)。（3）基因修飾基因修飾就是將有功能的目的基因?qū)朐l(fā)病灶的細(xì)胞或其他類型的相關(guān)細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物補(bǔ)償致病基因的功能，但致病基因本身未得到改變。（4）基因抑制基因抑制是指導(dǎo)入外源基因以抑制原有的基因，其目的在于阻斷有害基因的表達(dá)。（5）基因封閉利用反義RNA堿基互補(bǔ)原理，通過載體的介導(dǎo)性封閉或阻斷有害基因的表達(dá)，從而達(dá)到基因治療的目的。3.基因治療中基因轉(zhuǎn)移方法（1）基因轉(zhuǎn)移的物理方法基因轉(zhuǎn)移的物理方法包括：直接注射、電脈沖介導(dǎo)法和顯微注射微粒子轟擊法等。（2）基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法基因轉(zhuǎn)移的化學(xué)方法包括DNA磷酸鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色體介導(dǎo)法、脂質(zhì)體包埋、多聚季鐵鹽等化學(xué)試劑轉(zhuǎn)移方法。（3）基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法主要是指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，包括RNA病毒和DNA病毒兩類，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純疤疹病毒、痘苗病毒等。五、疾病的基因治療（一）遺傳性單基因疾病的基因治療是基因治療的理想侯選對(duì)象，設(shè)計(jì)治療方案時(shí)應(yīng)考慮下列幾點(diǎn)因素：⑴對(duì)造成該疾病有關(guān)的基因應(yīng)有較詳細(xì)的了解，并能在實(shí)驗(yàn)室克隆適合真核細(xì)胞表達(dá)的有關(guān)基因的cDNA序列，供轉(zhuǎn)導(dǎo)用；⑵經(jīng)有功能基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的體細(xì)胞，只要產(chǎn)生較少量原來缺少的基因產(chǎn)物就能矯正疾??；⑶即使導(dǎo)入基因過度表達(dá)，對(duì)機(jī)體應(yīng)無不良作用；⑷有些遺傳疾病是某些特殊細(xì)胞基因缺損造成的，但那有關(guān)的細(xì)胞不易取出供體外基因工程操作用；⑸現(xiàn)在采用的以正常有功能的同源基因來增補(bǔ)體內(nèi)的缺乏基因，因此要求增補(bǔ)的基因在病人壽命期間能穩(wěn)定表達(dá)，或重復(fù)治療，所以應(yīng)考慮構(gòu)建能長期持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源基因的載體，并考慮將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)干細(xì)胞。（二）病毒性感染目前病毒性感染主要治療對(duì)象為人免疫缺陷病毒（HIV）感染的艾滋病，主要有二種治療策略：①增強(qiáng)機(jī)體的抗HIV免疫反應(yīng)；②抑制HIV的復(fù)制。許多科學(xué)家尚在研究其他更有效的抑制HIV復(fù)制的方法。（三）惡性腫瘤惡性腫瘤屬復(fù)雜基因疾病(complexgeneticdiseases)，可能涉及多種基因的異常，發(fā)病過程是多步驟的，至今雖有不少有關(guān)的基因被鑒定，但腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未清楚，目前臨床惡性腫瘤的基因治療策略有十余種之多。主要的有：1.免疫基因治療(immunogenetheray)2.自殺基因系統(tǒng)3.抑癌基因(tumorsuppressivegene)4.裂解腫瘤病毒（oncolyticvirus）（四）心血管疾病目前心血管疾病中基因治療最多的臨床方案為外周血管疾病造成的下肢缺血，及心臟冠狀動(dòng)脈阻塞造成的心肌缺血。通過轉(zhuǎn)移血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）或成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）或血小板衍生生長因子（PDGF）等基因于血管病疫部位，通過這些因子的表達(dá)，以促進(jìn)新生血管的生成，從而建立側(cè)肢循環(huán)，改善血供。六、問題及展望基因療法作為一種新興的治療技術(shù)無疑是近30年來生命科學(xué)發(fā)展的一種結(jié)果。時(shí)代在發(fā)展，科技在進(jìn)步，理論在創(chuàng)新，高科技研究成果的出現(xiàn)如同任何新生事物的誕生一樣，運(yùn)用合理，將有無限的生機(jī)與活力；應(yīng)用不當(dāng)，也會(huì)給人類造成極大的隱患。隨著分子技術(shù)的飛速發(fā)展，期望基因治療會(huì)有一個(gè)美好的前景，實(shí)現(xiàn)真正的臨床突破，造福人類指日可待。

由病毒、衣原體、支原體、立克次體、細(xì)菌、真菌、螺旋體、原蟲、蠕蟲等引起的疾病稱為感染性疾病（infectiousdiseases）。感染性疾病中具傳染性并可導(dǎo)致不同程度流行則又稱傳染病（communicablediseases，contagiousdiseases）。第三節(jié)傳染病的防治一、新發(fā)和再發(fā)傳染病的特征

傳染病的致病因素是有生命的病原體，它在人體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展的過程與其他致病因素所造成的疾病有本質(zhì)上的區(qū)別，主要表現(xiàn)在：①有病原體：每一個(gè)傳染病都是由特異性的病原體所引起的；②有傳染性：這是傳染病與其他感染性疾病的主要區(qū)別。③有流行病學(xué)特征：傳染病的流行過程在自然和社會(huì)因素的影響下，表現(xiàn)出各種特征。④有感染后免疫：動(dòng)物、人體感染病原體后，無論是顯性或隱性感染，都能產(chǎn)生針對(duì)病原體及其產(chǎn)物(如毒素)的特異性免疫；⑤大多數(shù)傳染病都具有該種病特征性的綜合癥狀和一定的潛伏期和病程經(jīng)過。二、傳染病防治的新策略及研究內(nèi)容1.研究流行性傳染病的快速診斷技術(shù)

基因型是遺傳特征，相當(dāng)穩(wěn)定可靠，可以作為病原體鑒定和診斷的重要依據(jù)。通過從基因水平上進(jìn)行檢測，可進(jìn)行早期診斷，并可直接探知病原體在體內(nèi)的消長過程及其與機(jī)體相互作用而致機(jī)體損害的細(xì)節(jié)，從而在疾病表現(xiàn)型出現(xiàn)之前或早期采取相應(yīng)的防治措施。2.疫苗的研究

防治傳染病最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法是對(duì)易感人群進(jìn)行預(yù)防接種。利用DNA重組技術(shù)為基礎(chǔ)的各類工程疫苗有望成為防治傳染病的重要手段。3.預(yù)防和控制藥物的篩選科學(xué)家們正在積極制作基因藥物，希望能盡快篩選出對(duì)新病毒有預(yù)防和控制療效的藥物。4.分子流行病學(xué)規(guī)律研究從基因、基因組（蛋白、蛋白組，包括基因組和蛋白組的變異）、細(xì)胞和機(jī)體等不同層次，研究病毒與宿主的相互作用關(guān)系、致病機(jī)理、感染的分子過程等，揭示病毒源、病毒感染途徑、病毒性疾病的發(fā)生與流行規(guī)律等，為病源控制、診斷技術(shù)、疫苗研制、藥物篩選與研制、病毒性疾病流行預(yù)警等提供科學(xué)依據(jù)。5.遺傳進(jìn)化關(guān)系研究追本溯源，查明病原來源，確定病原與人、與動(dòng)物的關(guān)系，以有效控制疫病。三、基因工程疫苗所謂基因工程疫苗就是用基因工程方法或分子克隆技術(shù)，分離出病原的保護(hù)性抗原基因，將其轉(zhuǎn)入原核或真核系統(tǒng)使表達(dá)出該病原的保護(hù)性抗原，制成疫苗，或者將病原的毒力相關(guān)基因刪除掉，使成為不帶毒力相關(guān)基因的基因缺失苗。（一）基因工程亞單位疫苗上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)從病原分離得到的結(jié)構(gòu)組成具有免疫原性，這種非傳染性的亞單位能激發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)，而不具有由完整病原免疫可能帶來的副作用。（二）顆粒載體疫苗一些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以裝配成多聚體顆粒，將病原中編碼保護(hù)性抗原決定簇的基因片段融合到這些載體基因中，能表達(dá)并裝配成雜合顆粒，而病原的決定簇可能暴露于顆粒表面，賦與多個(gè)決定簇和顆粒性等優(yōu)點(diǎn)，其免疫原性大大優(yōu)于單價(jià)可溶性多肽疫苗。（三）病毒活載體疫苗

其原理是將外源目的基因插入載體病毒基因組的某些部位，使之高效表達(dá)但不影響該疫苗株的生存與繁殖。（四）細(xì)菌活載體疫苗

細(xì)菌活載體疫苗，除具有病毒活載體的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有培養(yǎng)方便、外源基因的容納量大、刺激細(xì)胞免疫力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因此具有巨大的潛力。（五）基因缺失疫苗基因缺失疫苗是通過基因工程方法，將與強(qiáng)毒株的毒力有關(guān)基因刪除，既不影響其增殖或復(fù)制，又保持其免疫原性的活疫苗。其突出的優(yōu)點(diǎn)是疫苗株穩(wěn)定，不易返強(qiáng)，十分安全。由于其免疫機(jī)制與感染相似，免疫針對(duì)多種抗原決定簇。（六）DNA重組疫苗它是指將編碼某種蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達(dá)載體直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。四、基因工程抗體

基因工程抗體是利用抗體工程技術(shù)在基因水平上對(duì)抗體分了進(jìn)行重組和改造，并導(dǎo)入原核、真核、酵母或重組病毒等表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)、生產(chǎn)的抗體。真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后修飾功能，能指導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的折疊、裝配和翻譯后修飾，使抗體分子更接近于人源蛋白，與原核表達(dá)系統(tǒng)有很大的差別。目前基因工程抗體的研發(fā)主要包括兩部分：一是對(duì)已有的單克隆抗體進(jìn)行改造，包括單克隆抗體的人源化(嵌合抗體、人源化抗體)、小分子抗體(Fab,ScFv,dsFv,diabody,minibody等)以及抗體融合蛋白的制備；二是通過抗體庫的構(gòu)建,使得抗體不需抗原免疫即可篩選并克隆新的單克隆抗體。五、DNA重組技術(shù)在傳染病防治前景展望

20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的基因工程為代表的生物技術(shù)為人與動(dòng)物傳染病預(yù)防與控制提供了新的手段，它大大沖擊和豐富了這一領(lǐng)域的研究，使新方法、新技術(shù)、新藥物和新構(gòu)思層出不盡。各種工程疫苗和抗體的產(chǎn)生為傳染病的防治掀開新的篇章，盡管目前在某些方面還不成熟，但人們相信隨著對(duì)生命本質(zhì)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，DNA重組技術(shù)和分子免疫學(xué)的發(fā)展，人們隨意制造疫苗和抗體消滅傳染病的時(shí)代即將到來。小結(jié)重組DNA技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展，并在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。例如，在疾病的診斷、治療、傳染病的防治中的應(yīng)用。復(fù)習(xí)思考題1. 簡述基因診斷的原理及特點(diǎn)?2. 基因診斷的方法有哪些?每種方法的原理如何?在疾病診斷中如何運(yùn)用?3. 簡述疾病基因治療的基本過程和治療方式?4. 用于疾病基因治療的載體有哪些?每種載體有何特點(diǎn)?5. 新發(fā)和再發(fā)傳染病有哪些特征?其防治的策略及研究內(nèi)容如何?6. 基因工程疫苗有哪些?每種特點(diǎn)如何?7. 基因工程抗體有哪些種類?如何構(gòu)建? 第十二章

基因敲除技術(shù)

基因敲除（Knockout）又稱為基因打靶，是指人為地從DNA分子水平上去除或替換某一個(gè)基因，使細(xì)胞內(nèi)的某種特定遺傳信息無法再表達(dá)，進(jìn)而從整體水平或細(xì)胞水平推測相關(guān)基因功能的一種技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)起源于20世紀(jì)80年代，是在基因同源重組技術(shù)和胚胎干細(xì)胞(EmbryonicStemcell，ES)技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?；蛲粗亟M技術(shù)是指當(dāng)外源DNA片段大且與宿主基因片段同源性強(qiáng)者并互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，結(jié)合區(qū)的任何部分都有與宿主的相應(yīng)片段發(fā)生交換(即重組)的可能，因此這種重組技術(shù)又稱為同源重組。所謂胚胎干細(xì)胞是從著床前胚胎(孕3—5天)分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Innercellmass，ICM)細(xì)胞，它具有向各種組織細(xì)胞分化的多分化潛能，能在體外培養(yǎng)并保留發(fā)育的全能性。在體外進(jìn)行遺傳操作后，將它重新植回小鼠子宮，該細(xì)胞能發(fā)育成胚胎的各種組織乃至于一個(gè)個(gè)體。基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入靶細(xì)胞基因組上某一特定位點(diǎn)上，以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一目的基因的一種技術(shù)。它包括如下主要步驟：①構(gòu)建重組載體；②重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)；③篩選目的細(xì)胞；④轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。這種方法的出現(xiàn)克服了隨機(jī)整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。該項(xiàng)技術(shù)的誕生是分子生物學(xué)技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、誘導(dǎo)性基因打靶系統(tǒng)的建立，使得對(duì)基因靶位時(shí)間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發(fā)展將為發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)及醫(yī)學(xué)等學(xué)科提供了一個(gè)全新的、強(qiáng)有力的研究、治療手段，具有廣泛的應(yīng)用前景。一、Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)基因敲除的重組載體系統(tǒng)主要有插入性載體系統(tǒng)和替換性載體系統(tǒng)。插入性載體系統(tǒng)構(gòu)建載體時(shí)主要包括：要插入的基因片段(目的基因)、同源序列片段、標(biāo)志基因片段等成分；替換性載體系統(tǒng)主要包括：同源序列片段、替換基因的啟動(dòng)子和報(bào)道基因等成分。Tsien等于1996年在《Cell》首先報(bào)道了第一個(gè)腦區(qū)特異性的基因敲除動(dòng)物，被譽(yù)為條件性基因敲除研究的里程碑。該技術(shù)以Cre/LoxP系統(tǒng)為基礎(chǔ)，因?yàn)镃re在哪種組織細(xì)胞中表達(dá)，基因敲除就能夠發(fā)生在哪種組織細(xì)胞中。下面就Cre-LoxP基因敲除系統(tǒng)的基本原理做簡要介紹。Cre-LoxP系統(tǒng)屬于傳統(tǒng)的同源重組載體,但是具有了時(shí)空調(diào)控的功能。它由Cre重組酶和LoxP位點(diǎn)兩部分組成。Cre重組酶于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區(qū)序列全長1029bp，編碼38kDa蛋白質(zhì)。是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。LoxP（locusofX-overP1）序列同樣來源于P1噬菌體，是有兩個(gè)13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的8bp序列共同組成，8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價(jià)結(jié)合，13bp的反向重復(fù)序列是Cre酶的結(jié)合域。當(dāng)兩個(gè)loxP序列方向相同并且位于同一條染色體上時(shí)，Cre編碼的重組酶蛋白能夠?qū)⑾嗤较虻膌oxP位點(diǎn)之間的核苷酸序列切除成為游離態(tài)，即有效切除兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的核苷酸序列；當(dāng)兩個(gè)LoxP的序列相反時(shí)，Cre重組酶使兩個(gè)loxP序列顛倒，并且這兩種反應(yīng)處于一種平衡狀態(tài)；當(dāng)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上面時(shí)，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條DNA的交換或促使染色體易位。Cre重組酶能識(shí)別34bp的部分回文的loxP序列，介導(dǎo)LoxP的34bp重復(fù)序列的位點(diǎn)特異性重組,切除同向重復(fù)的2個(gè)LoxP位點(diǎn)間的DNA片段和1個(gè)LoxP位點(diǎn)，同時(shí)保留1個(gè)LoxP位點(diǎn)，從而使兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列發(fā)生特異性的重組或刪除。該特性從而使得Cre-Loxp系統(tǒng)廣泛用于條件性基因敲除的研究。圖11-4Cre-LoxP介導(dǎo)的基因表達(dá)啟動(dòng)或關(guān)閉機(jī)制Cre不僅可以識(shí)別LoxP的2個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和8bp的間隔區(qū)域，而且當(dāng)一個(gè)13bp的反向重復(fù)序列或者8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變時(shí)仍能識(shí)別并發(fā)生重組。利用這一特點(diǎn)，人們在進(jìn)行構(gòu)建載體時(shí)可以根據(jù)需要改造LoxP位點(diǎn)序列用于基因突變或修復(fù)，增加了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。重組酶介導(dǎo)的盒式交換(recombinasemediatedcas-setteexchange,RMCE)方法就是以8bp的間隔區(qū)發(fā)生改變?yōu)榛A(chǔ)構(gòu)建的，同時(shí)結(jié)合盒式交換來突現(xiàn)動(dòng)物的表型而易于鑒別。與傳統(tǒng)的重組載體相比較，Cre-LoxP的不同點(diǎn)包括：在被Cre重組酶介導(dǎo)的重組發(fā)生前內(nèi)源基因功能正常，對(duì)基因組的任何改造必須位于編碼區(qū)以外或者內(nèi)含子區(qū)并且不干擾調(diào)節(jié)區(qū)域的功能；根據(jù)刪除片段的要求改變LoxP位點(diǎn)的插入方式可以得到不同的重組體；每段被改造的DNA片段都含有酶切位點(diǎn)便于用Southern印跡證實(shí)；便于區(qū)分打靶后不同細(xì)胞類型(野生型、打靶但未重組型、重組型)的顯像策略。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以用在細(xì)胞水平上，將Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中，通過識(shí)別LoxP位點(diǎn)將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在整體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，再通過二代遺傳就可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性基因敲除子代小鼠。例如，應(yīng)用該系統(tǒng)刪除小鼠X染色體雄激素受體基因產(chǎn)生雄激素受體基因缺失小鼠，就能夠闡述雄激素受體的功能是正常雌性動(dòng)物生產(chǎn)能力所必需