狗牙根改善胰島素抵抗活性部位的篩選 中藥學(xué)專業(yè)

前言糖尿病為當(dāng)前威脅人類健康的非傳染性疾?。╪oncommunicablediseases,NCD）之一，近年來，全球糖尿病發(fā)病率呈逐年增高趨勢。截至2015年，中國糖尿病患者已超過1億，位于世界首位，預(yù)計到2040我國糖尿病患者人數(shù)將增至超過1.5億人REF_Ref18778\r\h[1]。糖尿病發(fā)展到一定階段時，會出現(xiàn)各種并發(fā)癥如糖尿病足，高血癥，中風(fēng)，糖尿病腦病等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。2型糖尿病（type2disabetesmellitus,T2DM）是糖尿病的主要發(fā)病類型，約占該疾病的90%，系臨床常見的慢性內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。據(jù)統(tǒng)計調(diào)查，T2DM發(fā)病年齡越來越低齡化REF_Toc12780\r\h[2]，該問題為全人類社會帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，尋找有效藥物治療并預(yù)防2型糖尿病一直是各學(xué)者的研究熱點。T2DM的發(fā)病機制主要為胰島素抵抗（insulinresistance,IR）、β細(xì)胞分泌缺陷兩方面，而胰島素抵抗不僅是T2DM的始動因素，并且貫穿于T2DM發(fā)生的全過程REF_Toc31795\r\h[3]。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者中有約90%的患者存在IR，但目前對具體發(fā)病機制尚未闡明REF_Toc21527\r\h[4]。IR又稱胰島素敏感性下降，是指胰島素介導(dǎo)下的葡萄糖利用率降低的一個現(xiàn)象。因此，增強胰島素的敏感性、改善胰島素抵抗對于防治2型糖尿病具有重要意義。基于在人體內(nèi)進(jìn)行相關(guān)試驗研究存在著難度大、時間長、差異大等諸多問題，開展體外細(xì)胞試驗具有極其重要的意義REF_Ref30357\r\h[5]。體外建立細(xì)胞模型，模擬胰島素抵抗，是利用不同藥物直接作用各組織細(xì)胞，使各組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低，細(xì)胞在相同濃度胰島素刺激下葡萄糖的吸收量減少，產(chǎn)生胰島素抵抗。這種細(xì)胞模型復(fù)制周期較短、易于重復(fù)、影響因素易于控制，可以直觀、快捷的研究胰島素抵抗的發(fā)生機制，為篩選潛在改善胰島素抵抗作用的藥物提供方便。胰島素作用的靶器官主要有肝臟、脂肪和骨骼肌，目前體外研究胰島素抵抗的細(xì)胞模型與方法較多，但大多集中在這三種組織，主要有人正常肝細(xì)胞（L02）及肝癌細(xì)胞（HepG2）、骨骼肌細(xì)胞（L6）、小鼠脂肪細(xì)胞（3T3-L1）等REF_Toc21550\r\h[6]。由于肝臟是人體內(nèi)物質(zhì)代謝的中心，葡萄糖的攝取、儲存、合成及代謝主要在這里發(fā)生，其對于維持血糖穩(wěn)定具有直接而重要的作用，并且肝臟是人體胰島素受體最密集的器官之一，故肝臟代謝的紊亂對于IR的發(fā)生具有重要的意義REF_Toc30934\r\h[7]。目前使用的肝細(xì)胞模型大多是人肝癌細(xì)胞HepG2，該細(xì)胞系一種源于人的肝胚胎瘤細(xì)胞，且表型與人正常肝細(xì)胞極為相似。其保留有正常肝細(xì)胞的基本生物特征，利于體外培養(yǎng)，又沒有正常肝細(xì)胞所具有的易衰亡現(xiàn)象。在高濃度胰島素作用下，HepG2細(xì)胞表面胰島素受體數(shù)目下降，且下降程度與胰島素濃度及作用時間呈正相關(guān)。因此，HepG2細(xì)胞是研究IR發(fā)病機制和降糖物質(zhì)作用機制的理想細(xì)胞[8,9]。胰島素是通過其相對應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而使代謝反應(yīng)有序進(jìn)行，因此，胰島素信號通路任何地方發(fā)生功能障礙，均有可能引起IR。由于胰島素傳遞信號十分復(fù)雜，為了能更清楚地闡明IR產(chǎn)生的機理，學(xué)者們進(jìn)行了大量的體外研究，其中的主要手段就是采用細(xì)胞胰島素抵抗模型，目前大多數(shù)研究采用高濃度胰島素、高濃度葡萄糖、地塞米松、腫瘤壞死因子、游離脂肪酸等誘導(dǎo)IR細(xì)胞模型REF_Toc16463\r\h[10]。其中以高濃度胰島素和地塞米松作誘導(dǎo)劑的偏多。目前西醫(yī)上改善糖尿病胰島抵抗的藥物有雙胍類、噻唑烷二酮類、磺脲類及-葡萄糖苷酶抑制等，但隨著時間的推移，這些藥物潛在的副作用逐漸顯示出來，比如水腫、心臟衰竭、肝腎毒性等，這些使得這些藥物的臨床應(yīng)用受到限制，而中藥治療具有藥材來源豐富、價格便宜、副作用小、作用溫和、持久、多靶點整體性治療等優(yōu)勢，從而越來越受到各類學(xué)者的關(guān)注。大量的研究數(shù)據(jù)表明，中藥在防治改善胰島素抵抗方面發(fā)揮了重要作用，目前發(fā)現(xiàn)有改善胰島素抵抗作用的單味中藥達(dá)70余種，常用的有20余種。實驗研究表明，這些中藥的有效成分及其提取物主要有黃酮類、生物堿類、皂苷類、多糖類、揮發(fā)油、多酚類等。其中黃酮類主要為銀杏葉總黃酮，黃芩總黃酮，山楂葉總黃酮，葛根素等；生物堿類主要為小檗堿，梓醇等；皂苷類主要有人參皂苷，三七總皂苷，西洋參總皂苷，白芍總苷，吉祥草總皂苷等；多糖類主要為枸杞多糖，黃芪多糖等；揮發(fā)油主要為魚腥草揮發(fā)油；多酚類主要為白藜蘆醇；其他的有余甘子提取物REF_Toc1066\r\h[11]。狗牙根，原名鐵線草，系禾本科植物狗牙根Cynodondactylon（L.）Pars的全草，始載于《滇南本草》REF_Toc17578\r\h[12]；其分布廣泛，在我國的分布以黃河流域以南各省為主，其次在西南、西北、華中、華南及華北南部也有分布，是我國分布最廣、生態(tài)類型最多的野生暖季型草坪草REF_Ref30840\r\h[13]。據(jù)載，其味略苦微甘,性平，主入肝經(jīng)，并入肺、腎經(jīng)；具有祛風(fēng)活絡(luò)、解熱、止血、生肌之效；主治頭風(fēng)痛目眩、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痹痛、拘勞傷吐血、跌打損傷、刀傷、臃瘡、風(fēng)痰瘍軟、筋骨疲痛等癥REF_Toc5936\r\h[14]，研究表明其有降糖、抗菌、利尿等藥理作用。目前，國內(nèi)外學(xué)者開始對狗牙根在降血糖方面進(jìn)行了藥理研究。SaeidNafisi等REF_Toc13642\r\h[15]通過研究氯胺酮和賽拉嗪誘導(dǎo)持續(xù)并發(fā)的糖尿病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)狗牙根是治療糖尿病患者的良好替代藥物。KarthikD.等[16,17]實驗表明狗牙根水提物可以有效緩解高血糖和高血脂疾病，并且還能防止冠狀動脈心臟病并發(fā)。KarthikD.等REF_Toc8030\r\h[18]的大鼠高血糖實驗，說明狗牙根乙醇提取物能對糖尿病有治療作用，可減少高血糖、高脂血癥的風(fēng)險。E.EJarald等REF_Toc11422\r\h[19]從狗牙根水提物中分離出芹菜素、木犀草等4種黃酮類成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種黃酮類成分與鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白-2（SGLT2）靶點結(jié)合效果與達(dá)格列凈相似，該項研究為研究SGLT2抑制劑治療糖尿病神經(jīng)病變提供依據(jù)REF_Toc29408\r\h[20]。E.EJarald等REF_Toc11422\r\h[19]以四氧嘧啶誘導(dǎo)造模，通過比較狗牙根石油醚、氯仿、丙酮、乙醇、水部位的降血糖活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)狗牙根中水提取物的非多糖組分比水提取物活性更高。KhajaviRadA等REF_Toc22729\r\h[21]通過皮下注射甲苯磺丁脲誘導(dǎo)家兔暫時性高血糖模型，灌胃給藥一小時后測血糖水平，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，狗牙根組能顯著降低血糖。SinghSK等[22-24]實驗表明狗牙根水提取物和乙醇提取物均具有較好的降血糖和降血脂作用，但具體的降糖活性物質(zhì)還未確定。IR作為T2DM的發(fā)病基礎(chǔ)之一，一直是醫(yī)藥界的研究熱點。根據(jù)現(xiàn)代藥理藥效研究，狗牙根提取物具有較好的降血糖作用，但是對于狗牙根中具體的降糖活性物質(zhì)尚未明確，本課題擬采用高濃度胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立IR模型，對狗牙根各萃取部位促進(jìn)胰島素抵抗細(xì)胞糖吸收的活性進(jìn)行篩選，為后期狗牙根降血糖活性物質(zhì)的基礎(chǔ)研究提供參考，也為開發(fā)新型的胰島素增敏劑提供思路。2材料與儀器2.1實驗細(xì)胞HepG2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。2.2藥品與試劑狗牙根藥材購買于安徽亳州中藥材市場，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院陳磊副教授鑒定，確認(rèn)其為禾本科植物狗牙根Cynodondactylon（L.）Pars的干燥全草；新生牛血清（NBCS），杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國HyClone公司；青霉素/鏈霉素原液和胰蛋白酶，中國醫(yī)學(xué)科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；胰島素，Sigma；葡萄糖測試盒，南京建成生物工程研究所；磷酸緩沖鹽（PBS），天津市大茂化學(xué)試劑廠；WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（KGA316），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO），Amresco公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國NEST公司；實驗所配試劑用水均為雙蒸水；無水乙醇購自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。2.3主要儀器SERIES8000WJ型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThernoScientific）；SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)）；CDX41型倒置相差顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司上海分公司）；MJ-78A型全自動高壓蒸汽滅菌器（廣州飛迪生物科技有限公司）；DK-S22型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；DW-HW328型-80℃超低溫冰箱（中科美菱）；DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；S125D型十萬分之一分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；ELX800型全自動酶標(biāo)儀（BicTekInstruments）；TDL-80-2B型低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TG16MW2-16KL型低溫高速離心機（Sigma）；FD-1C-50型冷凍干燥器（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；BCD-216SMK型低溫冰箱（合肥美的榮事達(dá)電冰箱有限公司）；WP-UP-WF-10型微量分析型超純水機（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）。2.4試劑配制（1）HepG2細(xì)胞完全培養(yǎng)液：每100ml完全培養(yǎng)液中含有10ml新鮮牛血清（NBCS）和1ml雙抗溶液，其余為DMEM高糖培養(yǎng)基。（2）終止液：由10%NBCS加DMEM高糖培養(yǎng)液組成。（3）PBS緩沖溶液：取一包PBS混合干粉溶解于2L雙蒸水中，待完全溶解后，分裝于藍(lán)蓋瓶中，高壓蒸汽滅菌后放冷至室溫，密封放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）WST-1溶液：將新購置的5ml裝WST-1溶液先于超凈工作臺中分裝于1.5mlEP管中，1ml/管，用錫箔紙包好后于-20℃保存?zhèn)溆茫幻看闻R用前將WST-1溶液與DMEM高糖培養(yǎng)基以1:10（v:v）比例混勻后使用。（5）胰島素（Insulin）母液制備：精密稱取適量胰島素干粉（比如4mg），加入1ml冰醋酸使其完全溶解，加NaOH調(diào)PH至中性（7.2~7.6），再用雙蒸水定容至10ml，濃度為6.89×10-5mol/L，除菌，分裝，-20℃保存。（6）狗牙根總提取物及各萃取物的制備：狗牙根的干燥全草（20kg），用95%乙醇加熱回流提取3次，合并提取液并減壓濃縮浸膏。浸膏用蒸餾水溶解分散，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇三種不同極性的溶劑萃取3次，減壓回收溶劑，得石油醚，乙酸乙酯，正丁醇，水四個不同極性的部分。分別取總提取物及四個不同極性部位浸膏適量，然后用真空冷凍干燥器干燥后將各部分密封好于-20℃保存?zhèn)溆谩?實驗方法3.1HepG2細(xì)胞體外常規(guī)培養(yǎng)3.1.1細(xì)胞復(fù)蘇將取出的凍存管迅速置于37℃水浴中，并不時搖動，直到管中只剩下最后一片結(jié)晶，用75%酒精消毒后，在超凈臺中將含有HepG2細(xì)胞的凍存液緩慢加入預(yù)先加好3ml完全培養(yǎng)液的無菌離心管中，邊加邊搖勻，用移液槍吹打使細(xì)胞均勻懸浮。在1000rpm，室溫條件下離心3min，棄去上清液，再加入2ml完全培養(yǎng)液，吹打均勻，分別轉(zhuǎn)移至2個T25培養(yǎng)瓶，1ml/瓶，并每瓶補4ml完全培養(yǎng)液，而后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2換液當(dāng)培養(yǎng)液色黃時，應(yīng)進(jìn)行換液。具體操作：棄去瓶中舊的培養(yǎng)液，加入2mlPBS洗去殘留的細(xì)胞代謝物及細(xì)胞碎片，洗2次，棄去PBS，再加入5ml的完全培養(yǎng)液，后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長情況，培養(yǎng)1或2日換液。3.1.3細(xì)胞傳代當(dāng)細(xì)胞生長至鋪滿瓶底80%以上時，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。具體方法為：棄去瓶中舊的培養(yǎng)液，并用PBS洗2次，每次2ml，之后加入0.25%胰蛋白酶消化液1ml，置于培養(yǎng)箱中消化約2min，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)看到大多數(shù)細(xì)胞幾乎縮成圓形，細(xì)胞間隙增大時，迅速加入含10%新鮮牛血清（NBS）的DMEM高糖培養(yǎng)液2ml終止消化（于超凈工作臺上操作），溫和地反復(fù)吹打瓶壁，使細(xì)胞脫壁落掉，動作輕柔，以免產(chǎn)生過多的氣泡，之后將混勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入備好的無菌離心管中，在1000rpm下室溫離心3min。取出后棄去上清液，加2ml完全培養(yǎng)液，輕輕吹打使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)液中，然后接種到新的培養(yǎng)瓶中，一般接種2-3個培養(yǎng)瓶，補足培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3.1.4細(xì)胞凍存細(xì)胞的消化操作同傳代，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，24h前更換新鮮培養(yǎng)液，離心后棄去上清液，加入9份完全培養(yǎng)液和1份DMSO配成的凍存液制成細(xì)胞懸液，計數(shù)，令細(xì)胞密度達(dá)1~5×106個/ml，之后將細(xì)胞懸液分裝于凍存管中，1ml/管，標(biāo)上實驗員姓名、日期、細(xì)胞名稱及代數(shù)后將凍存管置于程序降溫盒內(nèi)，放入-80℃冰箱中，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中。3.2HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立3.2.1實驗分組（1）空白組：除了不加細(xì)胞，其余同對照組（2）對照組：正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞（3）模型組：給予含有不同濃度胰島素110-11、1×10-10、1×10-9、110-8、110-7、110-6、110-5mol/L的培養(yǎng)液3.2.2WST-1法檢測各組細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，加入適量正常培養(yǎng)液制成細(xì)胞混懸液，將細(xì)胞以104個/孔接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每塊板分為空白組、對照組和模型組，每組6個復(fù)孔。待細(xì)胞單層貼壁后，空白組和對照組加入正常培養(yǎng)液，模型藥組分別加入事先配制好的含有不同濃度胰島素的培養(yǎng)液，分別培育12h、24h、36h。作用時間完成后，棄去上清液，每孔加入110l稀釋好的WST-1液體，加好后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培育4h后用酶標(biāo)儀于450nm檢測，得到各孔的吸光度值（OD值），之后計算出各組細(xì)胞的存活率REF_Ref8843\r\h[25]。計算公式如下:（實驗組OD值-空白組OD值）細(xì)胞存活率%=×100（公式1）（對照組OD值-空白組OD值）細(xì)胞存活率越接近100%，說明胰島素作用濃度或作用時間對細(xì)胞活性影響越小。3.2.3胰島素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響參考文獻(xiàn)方法并略作改進(jìn)[26,27]。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后接種于96孔板中，每塊板分為空白組、對照組和模型組，對照組和不同濃度模型組加入細(xì)胞104個/孔，每孔100l，空白組加入培養(yǎng)液100l/孔。培育24h后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，空白組和對照組加入正常培養(yǎng)液，模型組分別加入新配置好的含有濃度胰島素110-11、1×10-10、1×10-9、110-8、110-7、110-6mol/L的培養(yǎng)液，分別培育12h，24h，36h。作用時間完成后，收集各組細(xì)胞上清液，經(jīng)離心后取上清液用葡萄糖測定試劑盒檢測其中的葡萄糖含量。檢測波長為570nm，以無細(xì)胞的空白組為空白對照，計算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量（Glucoseconsumption，GC）。此外，在取過上清液的96孔板各孔中均加入稀釋好的110lWST-1溶液，繼續(xù)培育4h后于450nm檢測吸光度值。為了考慮細(xì)胞增殖的影響，最后以GC/OD表示各組細(xì)胞葡萄糖消耗情況，以消除細(xì)胞數(shù)量差異帶來的影響REF_Toc13512\r\h[28]，通過這個方法優(yōu)化胰島素濃度和時間以建立適宜的高濃度胰島素誘發(fā)的HepG2細(xì)胞IR模型。該部分中涉及到的計算公式如下：各孔葡萄糖濃度（mmol/L）=標(biāo)準(zhǔn)品濃度×（樣品孔OD-空白孔OD）/（標(biāo)準(zhǔn)孔OD-空白孔OD）（公式2）GC（mmol/L）=空白組葡萄糖濃度-各組葡萄糖濃度（公式3）由上面方法選擇胰島素最佳作用濃度及胰島素最佳作用時間，建立由胰島素誘發(fā)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型。3.3WST-1法檢測狗牙根各萃取部位對HepG2細(xì)胞增殖活性的影響3.3.1實驗分組（1）空白組：除了不加細(xì)胞，其余同對照組（2）對照組：正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞（3）給藥組：給予含有藥物1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100g/ml的培養(yǎng)液3.3.2實驗步驟取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，加入適量正常培養(yǎng)液制成細(xì)胞混懸液，將細(xì)胞以104個/孔接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，每塊板分為空白組、對照組和給藥組。培養(yǎng)24h，棄去舊培養(yǎng)液，空白組和正常對照組加入正常培養(yǎng)液，不同濃度給藥組分別加入事先配制好的含有藥物1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100g/ml的培養(yǎng)液。藥物刺激24h后，用WST-1細(xì)胞活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞的生長情況，結(jié)果用細(xì)胞存活率表示，以此評價藥物對正常HepG2細(xì)胞增殖活性的影響。細(xì)胞存活率計算公式同公式1。3.4狗牙根各萃取部位對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響3.4.1實驗分組（1）空白組：除了不加細(xì)胞，其余同對照組（2）對照組：正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，不加受試藥物和造模劑（3）模型組：不加受試藥物預(yù)處理，給予含有1×10-7mol/L胰島素的培養(yǎng)液（4）藥物處理組：先給予含有濃度1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml藥物的培養(yǎng)液，再加造模劑造模3.4.2實驗步驟將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，加入適量正常培養(yǎng)液制成細(xì)胞混懸液，正常對照組、模型組和藥物處理組按104個/孔，每孔100l接種至96孔板中，空白組加入正常培養(yǎng)液100l/孔。培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)基，空白組、正常對照組和模型組加入正常培養(yǎng)液，藥物預(yù)處理組分別加入事先配制好的含有藥物1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml的培養(yǎng)液。預(yù)干預(yù)24h后，棄去細(xì)胞上清液，PBS洗滌2次后，空白組和對照組加入正常培養(yǎng)液，模型組和藥物處理組加入新配置好的含有1×10-7mol/L胰島素的培養(yǎng)液，培育24h。作用時間完成后，收集各組細(xì)胞上清液，經(jīng)離心后取上清液用葡萄糖測定試劑盒檢測其中的葡萄糖含量。檢測波長為570nm，以無細(xì)胞的空白組為空白對照，計算各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量（GC）。此外，在取過上清液的96孔板各孔中均加入稀釋好的110lWST-1溶液，繼續(xù)培育4h后于450nm檢測吸光度值。最后以GC/OD表示各組細(xì)胞葡萄糖消耗情況。計算方法同3.2.3。3.5統(tǒng)計分析采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，三組及三組以上間比較采用單因素ANOVA方差分析的方法，當(dāng)P<0.05表示差異具有顯著性，P<0.01表示差異具有極顯著性，兩種均具有統(tǒng)計學(xué)意義。4結(jié)果4.1胰島素對HepG2細(xì)胞增值的影響由表1可知，在不同胰島素濃度（1×10-11、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）分別作用HepG2細(xì)胞12h,24h,36h后，1×10-11~1×10-6mol/L濃度下的胰島素作用細(xì)胞的存活率與對照組相比，無顯著性差異（P>0.05）,說明對細(xì)胞增值無抑制作用。當(dāng)胰島素濃度為1×10-5mol/L時，表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞抑制作用（P<0.05或P<0.01），且隨著作用時間的增長，對細(xì)胞的增值抑制越大。故說明1×10-5mol/L的胰島素不適宜用來建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型。4.2胰島素對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響與對照組比較，若單位細(xì)胞消耗葡萄糖量減少（GC/OD值降低），則說明產(chǎn)生胰島素抵抗。通過表2可知，比對對照組，1×10-8mol/L胰島素作用24h，1×10-7mol/L胰島素作用24h、36h，1×10-6mol/L胰島素作用24h后均能顯著降低細(xì)胞對葡萄糖的消耗（P<0.05），但1×10-7mol/L胰島素在作用24h后對葡萄糖的消耗降低最明顯（P<0.01）；此外，1×10-9mol/L胰島素作用36h及1×10-6mol/L胰島素作用12h卻能顯著增加細(xì)胞對葡萄糖的消耗（P<0.05）；其余各組細(xì)胞對葡萄糖消耗有一定的變化，但均無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，故確定1×10-7mol/L胰島素作用24h為本實驗的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型最佳造模條件。此造模條件與一些學(xué)者的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型造模數(shù)據(jù)有差別，可能與細(xì)胞的來源，實驗條件及實驗方法有關(guān)。表1不同胰島素濃度作用不同時間對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=6）/100%胰島素濃度（mol/L）作用時間/h122436對照組（0）100.0±3.9100.0±15.4100.2±24.610-1199.8±3.7103.3±12.2112.2±2.310-10107.6±2.7103.1±11.7114.5±22.510-9107.5±3.999.1±12.1111.5±18.210-8109.4±2.7100.1±12.6116.4±16.410-7108.2±4.1101.2±15.0112.0±21.110-698.7±2.8105.3±10.9115.2±8.910-574.4±1.5*36.6±6.7**31.3±3.8**注：與對照組比較，*表示差異顯著（P<0.05）,**表示差異極其顯著（P<0.01）。下同。表2不同胰島素濃度作用不同時間對HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=6）GC/OD胰島素濃度（mol/L）作用時間/h122436對照組（0）1.224±0.2462.207±0.3442.396±0.18710-111.091±0.4162.156±0.4582.248±0.25610-101.630±0.2002.017±0.0862.638±0.35210-91.131±0.5362.169±0.2402.740±0.133*10-81.141±0.3841.727±0.162*2.483±0.23110-71.250±0.2121.486±0.436**1.947±0.059*10-61.826±0.430*1.702±0.520*2.143±0.2514.3狗牙根各萃取部位對正常HepG2細(xì)胞增殖活性的影響如表3-1~表3-5所示，加狗牙根不同濃度各萃取部位刺激細(xì)胞24h后，與對照組比較，總提取物在25、50、100ug/ml濃度組及水部位在100ug/ml濃度組下均能顯著提高細(xì)胞的存活率（p<0.01）；而乙酸乙酯部位在25、50、100ug/ml濃度組下對細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用（p<0.01），且隨濃度增加，抑制越明顯，在100μg/ml濃度時，細(xì)胞存活率只有43.9%；石油醚部位和正丁醇部位各濃度組對細(xì)胞存活率無顯著影響（p>0.05）。綜上，確定各萃取物的給藥濃度為1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml。4.4狗牙根各萃取部位對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響如表4-1~表4-5所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞葡萄糖消耗明顯下降（P<0.01），即產(chǎn)生胰島抵抗；與模型組比較，狗牙根總提取物在12.5g/ml濃度組明顯增加細(xì)胞葡萄糖消耗（P<0.05），其余濃度組對細(xì)胞葡萄糖消耗無明顯影響，另外在本實驗濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞葡萄糖的消耗量隨著狗牙根總提取物濃度的增大逐漸增加，提示一定的劑量依賴性；石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位在本實驗給藥濃度范圍內(nèi)均顯著增加細(xì)胞葡萄糖的消耗（P<0.01），其中乙酸乙酯部位對細(xì)胞葡萄糖的消耗量隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性，在12.5g/ml時最大，增加的細(xì)胞葡萄糖消耗率達(dá)57.6%，正丁醇部位對細(xì)胞葡萄糖消耗的影響在1.5625~12.5g/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)一個先升高后降低的趨勢，在3.125g/ml時增加細(xì)胞葡萄糖的消耗率最大，達(dá)37.8%；石油醚部位對葡萄糖的消耗隨濃度的變化不大；水部位在1.5625、6.25g/ml濃度組能明顯改善細(xì)胞葡萄糖消耗（P<0.05，或P<0.01），但在12.5g/mL濃度時降低細(xì)胞葡萄糖的消耗。綜上，在本實驗濃度范圍內(nèi)（1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml）乙酸乙酯部位改善高胰島素誘導(dǎo)的IR-HepG2細(xì)胞的活性相對最好，其次是正丁醇部位、石油醚部位，最后是水部位。表3-1狗牙根總提取物對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)存活率(%)對照組0100.0±6.51.562599.5±4.73.12596.8±4.2總提取物6.25101.8±5.212.5101.0±4.125110.1±4.0**50114.0±3.6**100117.3±4.2**注：n=6，與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，下同。表3-2狗牙根石油醚部位對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)存活率(%)對照組0100.0±2.01.562598.2±7.03.12598.3±4.5石油醚部位6.25100.1±2.412.5102.0±3.225102.6±2.450101.7±0.5100103.2±1.4表3-3狗牙根正丁醇部位對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)存活率(%)對照組0100.0±2.91.562598.6±3.43.12599.1±3.5正丁醇部位6.2596.4±9.612.597.9±8.02595.3±9.550101.5±6.4100104.1±11.8表3-4狗牙根乙酸乙酯部位對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)存活率(%)對照組0100.0±4.91.5625101.3±5.83.12599.9±2.5乙酸乙酯部位6.2599.3±2.212.594.6±2.32587.8±7.7**5074.2±4.5**10043.9±6.4**表3-5狗牙根水部位對HepG2細(xì)胞存活率的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)存活率(%)對照組0100.0±4.71.562596.2±4.83.125100.9±7.6水部位6.25100.8±5.312.5103.6±3.425105.8±12.650104.9±6.7100115.9±5.1**表4-1狗牙根總提取物對IR-HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of對照組）對照組01.556±0.128100.0模型組01.202±0.071##77.3總提取物1.56251.247±0.06580.13.1251.251±0.064##80.46.251.356±0.190#87.112.51.398±0.140*89.8注：n=6，與對照組比較，#p<0.05，##p<0.01與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01，下同。表4-2狗牙根石油醚部位對IR-HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of對照組）對照組02.019±0.071100.0模型組01.575±0.064##78.0石油醚部位1.56252.050±0.147**101.53.1252.031±0.260**100.66.252.082±0.125**103.112.51.965±0.090**97.3表4-3狗牙根乙酸乙酯部位對IR-HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of對照組）對照組02.117±0.107100.0模型組01.518±0.097##71.7乙酸乙酯部位1.56251.986±0.094**93.83.1252.067±0.290**97.66.252.259±0.214**106.712.52.738±0.216**129.3表4-4狗牙根水部位對IR-HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of對照組）對照組03.609±0.069100.0模型組03.060±0.111##84.8水部位1.56253.302±0.199*91.53.1253.267±0.05090.56.253.462±0.056**95.912.52.838±0.104*78.6表4-5狗牙根正丁醇部位對IR-HepG2細(xì)胞糖消耗的影響（n=6）組別給藥濃度(μg/ml)GC/ODGC/OD（%of對照組）對照組02.680±0.360100.0模型組02.190±0.359#81.7正丁醇部位1.56252.789±0.190**104.13.1253.203±0.212**119.56.252.855±0.291**106.512.52.932±0.409**109.45討論應(yīng)用疾病模型進(jìn)行篩選實驗是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)的一個重要研究手段，因此建立可靠的疾病模型對于藥物篩選來說極其重要。本實驗擬建立胰島素抵抗的細(xì)胞模型來篩選藥物的有效部位，選定合適的細(xì)胞來源是首要任務(wù)。肝臟是人體內(nèi)物質(zhì)代謝的中心，在糖代謝中起著非常重要的作用。并且肝臟是人體胰島素受體最密集的器官之一,對胰島素的促攝糖作用極為敏感。本實驗選用來源于肝細(xì)胞、具有肝細(xì)胞生物特性的HepG2細(xì)胞經(jīng)高胰島素誘導(dǎo)使之成為胰島素抵抗的細(xì)胞模型,在一定程度上模擬了胰島素抵抗的自然發(fā)病過程。HepG2細(xì)胞表面的胰島素受體數(shù)目受胰島素水平和作用時間的調(diào)節(jié)，當(dāng)胰島素受體數(shù)目下調(diào)到一定程度時,則該細(xì)胞對胰島素的作用產(chǎn)生抗性。本實驗中，通過胰島素體外誘導(dǎo)法確定HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的最佳作用時間及作用濃度，建立胰島素抵抗模型。實驗結(jié)果顯示，不同濃度胰島素刺激HepG2細(xì)胞，誘導(dǎo)IR時，1×10-7mol/L的胰島素作用24h后細(xì)胞的葡萄糖消耗量最低，且細(xì)胞存活率也不受影響，故確立1×10-7mol/L的胰島素濃度為胰島素抵抗的最佳濃度，24h為胰島素抵抗作用的最佳時間。該條件為本次實驗的建模條件。用不同濃度的狗牙根各萃取部位作用于正常HepG2細(xì)胞以確定給藥濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了乙酸乙酯部位在25、50、100g/ml濃度時顯著抑制細(xì)胞增殖，有一定的細(xì)胞毒作用之外，其余各不同濃度萃取部位對細(xì)胞均無明顯的細(xì)胞毒作用，因此確定各萃取部位的給藥濃度為1.5625、3.125、6.25、12.5g/ml。利用所建立的胰島素抵抗模型對狗牙根各萃取部位的活性進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位在實驗給藥濃度范圍內(nèi)均具有較好的活性，而相比之下，乙酸乙酯部位表現(xiàn)出較好的劑量依賴性，活性也更好一些；總提物在12.5g/ml時和水部位在1.5625、6.25g/ml時也表現(xiàn)出一定的活性，但是相對乙酸乙酯部位、石油醚部位和正丁醇部位而言其活性較差。6結(jié)論本實驗選用1×10-7mol/L胰島素作用24h建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型，并利用該模型對狗牙根各萃取部位進(jìn)行活性篩選，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)狗牙根總提取物及各萃取部位對高胰島素誘導(dǎo)的IR-HepG2模型均有一定的改善作用，其中乙酸乙酯部位的活性相對最好，其次是石油醚和正丁醇部位，總提取物和水部位的活性相對較差。參考文獻(xiàn)AkramTKharroubi,HishamMDarwish.Diabetesmellitus:Theepi-demicofthecentury[J].WorldJournalofDiabetes,2015,6(6):850-857.汪會琴,胡如英,武海濱.2型糖尿病報告發(fā)病率研究進(jìn)展[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2016,28(1):37-57.陸菊明.胰島素抵抗與2型糖尿病的發(fā)生關(guān)系[J].藥物與臨床,2014,11(23)：12-15.中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.中國2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志,2015,7(3):27.許樂,逄曉陽,蘆晶,等.HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及其應(yīng)用[J].核農(nóng)學(xué)報,2017,31(9):1775-1781.張世卿,佟麗.胰島素抵抗作用發(fā)生機制及動物模型研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理,2012,23(3):364-368.StaehrP.,Hother-NielsenO.,Beck-NielsenH..Theroleoftheliverintype2diabetes[J].Reviewsinendocrine&metabolicdisorders.2004,5:105-110.陳夢云,江國榮.胰島素抵抗細(xì)胞模型研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(6)；141-143.GumellM,SavageDB,ChatterjeeVK.Themetabolicsyndrome:Peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammaanditstherapeuticmodulation[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism.2003,88(6):2412-2421.張澤生,李雨蒙,張夢娜,等.胰島素抵抗細(xì)胞模型建立及藥物評價的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑,2016,10:198-203.趙軒,高彥彬.改善胰島素抵抗的單味中藥成分和作用機制研究[J].世界中醫(yī)藥,2013,8(7):840-843.國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》.中華本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.張純禮.草藥鐵線錢臨床介紹[J].云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1985(30).唐欣,向佐湘,蘇鵬.狗牙根研究進(jìn)展[J].作物研究,2009,05:383-386.NafisiS,NezhadyMAM,AsghariMH.ComparativeandMixtureEffectofCynodonDactylon,ElectroMagneticFieldandInsulinonDiabeticMouse[J].Balkanmedicaljournal,2012,29(4):345.KarthikD,RavikumarS.Characterizationofthebrainproteomeofratswithdiabetesmellitusthroughtwo-dimensionalelectrophoresisandmassspectrometry[J].Brainresearch,2011,1371:171-179.KarthikD,RavikumarS.ProteomeandphytochemicalanalysisofCynodondactylonleavesextractanditsbiologicalactivityindiabeticrats[J].Biomedicine&PreventiveNutrition,2011,1(1):49-56.KarthikD,RavikumarS.AstudyontheprotectiveeffectofCynodondactylonleavesextractindiabeticrats[J].BiomedicalandEnvironmentalSciences,2011,24(2):190-199.JaraldEE,JoshiSB,JainDC.AntidiabeticactivityofaqueousextractandnonpolysaccharidefractionofCynodondactylonPers[J].Indianjournalofexperimentalbiology,2008,46(9):660.AnnapurnaHV,ApoorvaB,RavichandranN,etal.IsolationandinsilicoevaluationofantidiabeticmoleculesofCynodondactylon(L.)[J].JournalofMolecularGraphicsandModelling,2013,39:87-97.KhajaviRadA,HadjzadehMAR,RajaeiZ,etal.ThebeneficialeffectofCynodondactylonfractionsonethyleneglycol-inducedkidneycalculiinrats[J].Urologyjournal,2011,8(3):179-184.SinghSK,RaiPK,MehtaS,etal.CurativeeffectofCynodondactylonagainstSTZinducedhepaticinjuryindiabeticrats[J].IndianJournalofClinicalBiochemistry,2009,24(4):410-413.SinghSK,RaiPK,JaiswalD,etal.Evidence-basedcriticalevaluationofglycemicpotentialofCynodondactylon[J].Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2008,5(4):415-420.SinghSK,KesariAN,GuptaRK,etal.AssessmentofantidiabeticpotentialofCynodondactylonextractinstreptozotocindiabeticrats[J].Journalofethnopharmacology,2007,114(2):174-179.顧愛彤,張卿,王峰.安息香保護內(nèi)皮損傷的活性成分初步研究[J].廣東化工,2017,44(14):11-12.姜保平,樂亮,許利嘉,等.HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及在篩選兩色金雞菊活性化合物中的應(yīng)用[J].中國現(xiàn)代中藥,2017,19(2):165-173.方飛.桑葉有效部位改善HepG2胰島素抵抗及其機制的研究[D].華南理工大學(xué),2012.ZhengXK,YoonNY,BaeHJ,etal.AntigyperglycemicactivityofSelaginellatamariscina(Beauv.)Spring[J].JournalofEthnoparmacology.2011,133(2):531-537.綜述中藥抗2型糖尿病胰島素抵抗的研究進(jìn)展隨著生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率逐年增加，已成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。臨床上主要有1型糖尿病和2型糖尿病，其中2型糖尿病最為常見，占糖尿病人總數(shù)的90%以上，而且發(fā)病年齡越來越年輕化REF_Ref14919\r\h[1]。胰島素抵抗（insulinresistance,IR）是指正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)，包括靶器官對胰島素的敏感性降低和對胰島素的反應(yīng)性降低REF_Ref15559\r\h[2]。胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，也是高血壓、高血脂、冠心病等疾病的主要發(fā)病原因。雖然西藥降血糖作用強、起效快，但往往缺乏整體的協(xié)調(diào)性，且具有明顯的副作用，不利于糖尿病患者長期使用。近年來現(xiàn)代中藥對糖尿病的研究有了進(jìn)一步的深入，諸多研究表明中藥治療糖尿病多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)，是綜合治療作用的體現(xiàn)。因此，從中藥中尋找新的降血糖藥物，對提高患者的整體狀況有獨特的優(yōu)勢REF_Ref15775\r\h[3]。本文就近年來各學(xué)者在研究中藥治療2型糖尿病胰島素抵抗方面進(jìn)行綜述。1胰島素抵抗的中醫(yī)病機研究2型糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，病位重點在脾、肝、腎。為脾失健運，肝失疏泄，腎陽不化等臟腑功能失調(diào)所致。脾胃功能失調(diào)是IR發(fā)生的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，肝失調(diào)達(dá)則肝糖原合成減少，肝糖原分解加速，腎陽不化，水濕內(nèi)停是加重IR的重要環(huán)節(jié)；痰濁、瘀血產(chǎn)生IR還與高胰島素血癥、胰島素拮抗激素的升高、血黏度增高有關(guān)，減弱胰島素促進(jìn)外周組織（肌肉、脂肪細(xì)胞）攝取和利用葡萄糖及抑制肝糖輸出的效應(yīng)而產(chǎn)生IRREF_Ref15807\r\h[4]。1.1IR與脾中醫(yī)認(rèn)為脾主運化、統(tǒng)血、輸布精微，是水谷精微代謝的主要臟器?！端貑枴そ?jīng)脈別論篇》所述“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾。脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱。水精四布，五經(jīng)并行”?！鹅`樞·本臟》記載：“脾脆則善病消癉”；《素問·奇病論篇》記載：“此人必數(shù)食甘美而多肥也，轉(zhuǎn)為消渴”。病理狀態(tài)下，當(dāng)各種致病因素影響到脾的運化功能時，脾失健運，不能將水谷精微“灌溉四旁”，其轉(zhuǎn)輸和散精功能減退，從而產(chǎn)生痰濕、濁瘀等病理產(chǎn)物，更重要的是水谷已轉(zhuǎn)化的精微無法布散至肺、胃、腎，使其失去滋養(yǎng)而陰津不足由此產(chǎn)生多種病癥REF_Ref15850\r\h[5]。痰濕內(nèi)蘊可導(dǎo)致肥胖、高血糖、高血脂；痰濕內(nèi)阻可致瘀，阻滯氣機，可導(dǎo)致高血壓；痰濁上泛，可導(dǎo)致中風(fēng)；痰濁瘀血相互搏結(jié)，又可加重IR，脂糖代謝紊亂，變證叢生。江南等REF_Ref15889\r\h[6]認(rèn)為2型糖尿病等代謝疾病的IR實質(zhì)是脾氣虛導(dǎo)致的痰濕內(nèi)生，因陽虛及痰濕生瘀，因痰瘀滯留而生毒，部位重點在脾，和肝腎密切相關(guān)。1.2IR與肝中醫(yī)認(rèn)為肝主疏泄，調(diào)暢氣機，且肝為剛臟，五行屬木，喜條達(dá)而惡抑郁。肝失疏泄可致內(nèi)分泌功能紊亂，《靈樞》曰：“肝脆則善病消癉易傷?！备螝庥艚Y(jié)、肝經(jīng)實熱、肝血瘀滯很可能是IR的致病因素之一REF_Ref15931\r\h[7]。飲食不節(jié)，過食肥甘，好逸惡勞，氣血壅盛易致形體肥胖，痰濕內(nèi)阻，郁遏肝氣;長期的精神刺激，緊張壓抑，易怒傷肝，肝失條達(dá)，氣機紊亂;素體陰虛，勞欲過度，腎陰匱乏而致肝陰不足，肝失疏泄，致使氣血津液等精微物質(zhì)不能輸布，積聚不化，濕濁內(nèi)生，成痰成瘀，這些病理產(chǎn)物又會進(jìn)一步影響肝之疏泄，繼而引起臟腑功能紊亂，導(dǎo)致IR的產(chǎn)生發(fā)展REF_Ref15974\r\h[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肝臟很可能是體內(nèi)胰島素最大的調(diào)節(jié)器官，可影響人體對胰島素的敏感性。王智明REF_Ref16016\r\h[9]等研究表明肝氣郁結(jié)可作為2型糖尿病發(fā)病的始動因素，而諸多變證均是在氣機郁滯基礎(chǔ)上發(fā)生的。而近代研究也發(fā)現(xiàn)REF_Ref16088\r\h[10]，肝臟胰島素抵抗在胰島素抵抗研究中占據(jù)重要位置。1.3IR與腎中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，主水，為先天之本。陳士鐸《石室秘錄》曰：“消渴之證，雖分上中下，而腎虛而致，則無不同也。”張景岳在《景岳全書·痰飲》中說：“五臟之病，雖皆能生痰，然無不由于脾腎。蓋脾主濕，濕動則為痰；腎主水，水泛亦為痰”。腎氣不足，會影響其他臟腑。如腎之陽氣不足，會引起脾陽不足，影響水液代謝功能，從而產(chǎn)生痰濕、血瘀等病理產(chǎn)物，導(dǎo)致IR發(fā)生REF_Ref15807\r\h[4]。IR多發(fā)病于中年，可能與人到中年以后腎氣不足有關(guān)。徐麗君等REF_Ref16140\r\h[11]認(rèn)為，根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，糖尿病以虛為本，雖然病變可累及肺、脾、腎等臟腑，但腎虛為病機的中心環(huán)節(jié)，其病理生理基礎(chǔ)為IR。有學(xué)者認(rèn)為脾腎同病的IR以健腎補脾泄?jié)岱ㄖ委煰熜Ц肦EF_Ref16193\r\h[12]。2中藥對抗2型糖尿病胰島素抵抗研究2.1單味中藥中藥在改善2型糖尿病胰島素抵抗中的作用不容小覷：中醫(yī)有記載能治療消渴病的中藥達(dá)70余種,其中臨床上常用的有黨參、人參、黃芪、生地黃、茯苓、薏苡仁、丹參、刺五加、白芍、生龍骨、生牡蠣、當(dāng)歸、知母、天花粉、大黃、鹿茸、蒼術(shù)、白術(shù)、川芎、山藥、麥冬、玉竹、天冬、五味子、山萸肉、地骨皮、僵蠶、甘草、仙靈脾、玄參等30余種REF_Ref16238\r\h[13]。單味中藥一般都有一定的作用靶點改善IR，其作用機制主要體現(xiàn)在三方面:改善胰島β細(xì)胞功能，刺激胰島素分泌;增加胰島素受體數(shù)目、增強胰島素的敏感性;抑制胰島素拮抗物質(zhì)的分泌以及促進(jìn)葡萄糖降解，最終達(dá)到改善IR的作用REF_Ref16278\r\h[14]。李宗友REF_Ref16313\r\h[15]觀察胡蘆巴乙醇提取物(4-羥基異亮氨酸)對大鼠胰腺的作用時發(fā)現(xiàn)，此化合物主要作用于β細(xì)胞血漿膜的K+通道，刺激胰島素分泌。程秀珍等REF_Ref16369\r\h[16],用高熱量飼料加小劑量鏈脲佐菌素建立實驗性2型糖尿病大鼠模型后，用葛根、丹參、大黃治療6周，測定空腹血糖、血脂、血清胰島素，計算出胰島素敏感指數(shù)，結(jié)果表明,葛根、大黃能降低實驗性2型糖尿病大鼠空腹血糖、血脂，提高胰島素敏感指數(shù)，改善IR。喬琳琳等REF_Ref16425\r\h[17]研究發(fā)現(xiàn)黃連煎劑可以明顯改善IR，減少內(nèi)臟脂肪，上調(diào)p-AMPK-α的蛋白表達(dá)明顯優(yōu)于黃連提取物鹽酸小檗堿。鄭琳穎等REF_Ref16467\r\h[18]發(fā)現(xiàn)白芍總苷能夠拮抗大鼠的高胰島素血癥和IR，提高胰島素的敏感性，降低血脂水平以及增強抗氧化能力。此外，朱榮強等REF_Ref16506\r\h[19]觀察黃芪注射液改善60例2型糖尿病IR的作用，結(jié)果顯示,黃芪注射液可以顯著改善2型糖尿病IR。王欽茂等REF_Ref16555\r\h[20]研究提示丹皮多糖純品2b可降低四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病小鼠模型的糖化血紅蛋白水平，改善其口服葡萄糖耐量和IR，并認(rèn)為其機制可能與促進(jìn)外周組織對葡萄糖的利用，提高胰島素的敏感性有關(guān)。何勝等REF_Ref16594\r\h[21]實驗發(fā)現(xiàn)鐵皮石槲對衰老糖尿病模型小鼠有明顯的降血糖作用。李潤生等REF_Ref16627\r\h[22]觀察紅景天制劑（諾迪康）對糖尿病腎病患者的治療作用，患者血糖、尿蛋白、HbAlc和β2-MG均較治療前明顯下降，表明諾紅景天糖尿病腎病具有很好的保護作用。劉穎等REF_Ref16676\r\h[23]采用正常血糖高胰島素鉗夾法評價不同劑量卷柏對IR大鼠模型胰島素敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)高劑量組胰島素敏感性指標(biāo)M值有明顯改善,低劑量組能促進(jìn)胰島素的分泌，但無降低血糖作用，表明高劑量組卷柏對IR有明顯改善。杜仲能顯著提高糖尿病小鼠對胰島素的敏感性且高劑量杜仲煎液的胰島素增敏效應(yīng)有可能優(yōu)于羅格列酮REF_Ref16722\r\h[24]。吳迪炯等REF_Ref16829\r\h[25]采用高胰島素誘導(dǎo)建立胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞模型的方法，探討丹參對胰島素敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)含有丹參的胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖摻入率明顯增高，說明丹參對細(xì)胞水平的胰島素抵抗有一定的抑制作用。此外，人參含人參多糖、人參皂甙和齊墩果糖類,能興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，加快神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，又能興奮垂體—腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng),增強腎上腺皮層功能，提高機體對外界不良條件刺激的抵抗力，因此能增強胰島素的敏感性。黃芪含膽堿、葉酸、數(shù)種氨基酸等成分,能興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能增強網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能,提高抗病能力,故可預(yù)防外源性所致胰島素抵抗。地黃含梓醇地黃素、維生素A類物質(zhì)、糖類及氨基酸，有輕微降血糖作用,能影響肝糖的代謝，使異常和紊亂的糖代謝向正常轉(zhuǎn)化。白術(shù)含有揮發(fā)油，油中主要成分為蒼術(shù)醇和蒼術(shù)酮，并含維生素A類物質(zhì),有降血糖、保護肝臟、防止肝糖原減少的作用，增加機體對胰島素的敏感性。麥冬含有甾體皂甙等物質(zhì)，可直接刺激胰島B細(xì)胞釋放胰島素，其作用類似磺脲類,能使胰島細(xì)胞功能恢復(fù)正常。茯苓含茯苓聚糖、茯苓酸、蛋白質(zhì)、脂肪、卵磷脂、組織胺、膽堿、麥角甾醇、鉀鹽、酵素、腺嘌呤等，有利尿、鎮(zhèn)靜、降血糖的作用,同時能改善胰島素與胰島素受體的結(jié)合率。枸杞子含胡蘿卜素、維生素B1、B2、C、煙酸、鈣、磷、鐵、及B-谷甾醇、亞油酸等，能輕微抑制脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉淀和促進(jìn)肝細(xì)胞新生的作用，能改善糖耐量，能提高肝糖原和肝葡萄糖酶活性，其改善胰島素抵抗的機理與調(diào)節(jié)糖代謝酶活性有關(guān)REF_Ref16238\r\h[13]。2.2活性成分中藥的有效成分及其提取物主要有黃酮類、生物堿類、皂苷類、多糖類、揮發(fā)油等。2.2.1黃酮類黃酮類主要分布在雙子葉植物中，且大多數(shù)以苷的形式存在。銀杏葉總黃酮具有擴張血管、降血脂、調(diào)節(jié)生物轉(zhuǎn)化和基因代謝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功能，唐嘉航REF_Ref16872\r\h[26]等實驗證明其能有效調(diào)節(jié)IR大鼠血糖和血脂水平，增加胰島素敏感性；山楂具有助消化、降血脂等功能，劉江REF_Ref16918\r\h[27]等實驗證明山楂葉總黃酮對IR大鼠高血脂和氧化損傷起到了良好的防治作用，能夠改善病鼠IR狀態(tài)，增強其胰島素敏感性，并具有良好的防治脂肪肝作用。2.2.2生物堿類生物堿是一類含氮的有機化合物，大多具有復(fù)雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是中草藥的重要有效成分之一。Semwal等REF_Ref16957\r\h[28]從防己提取獲得掌葉防己堿，并通過動物實驗發(fā)現(xiàn)其能降低糖尿病小鼠的空腹血糖并能提高血清中胰島素的含量，從而改善IR；從中藥黃連提取得到的小檗堿在降血糖和改善胰島素抵抗癥狀方面也有較多的研究報道，顯示療效確切、機制復(fù)雜REF_Ref17022\r\h[29]。羅春梅等REF_Ref17061\r\h[30]認(rèn)為黃連的有效成分黃連素作用類似于二甲雙胍，能有效促使肝糖原合成增加，通過葡萄糖的非氧化途徑改善IR。2.2.3皂苷類苷是以苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，其具有廣泛的藥理活性，如解熱、鎮(zhèn)靜、抗菌等。郭潔文等REF_Ref17104\r\h[31]系列研究表明：荔枝核提取物皂苷能改善實驗性T2DM伴IR模型大鼠血糖、血脂、胰島素、ISI、瘦素、TNF-α等指標(biāo)，糾正相關(guān)脂肪細(xì)胞因子，改善糖脂代謝紊亂，增強胰島素敏感性；胡蘆巴皂苷可在不增加胰島素分泌的情況下發(fā)揮降糖作用，其作用機理可能是其能增加2型糖尿病模型鼠對胰島素的敏感性REF_Ref17146\r\h[32]。2.2.4多糖類多糖是一類至少由10個單糖分子通過苷鍵聚合而成的高分子碳水化合物，分為均一性多糖和不均一性多糖。研究表明，從中藥里提取、分離獲得的多糖類物質(zhì)能降血糖和改善胰島素抵抗癥狀的作用，不少學(xué)者還對其降糖機理作進(jìn)一步深入的研究。麥冬的多糖含量能有效改善胰島素敏感性，使周圍組織對胰島素的抵抗降低。黃芪多糖能夠調(diào)節(jié)糖脂代謝，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，具有改善IR的作用，因此廣泛運用于T2DM、肥胖和代謝綜合征等代謝相關(guān)性疾病的防治。2.2.5揮發(fā)油類魚腥草揮發(fā)油具有殺菌抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫的作用，增加毛細(xì)血管韌性，降低毛細(xì)血管通透性，抑制炎性遞質(zhì)的釋放，提高血清備解素水平，增強機體免疫能力，利尿降血脂，抑制血小板凝集作用等功效。王海穎等REF_Ref17205\r\h[33]進(jìn)行了魚腥草揮發(fā)油對糖尿病大鼠血脂和IR影響的研究。研究發(fā)現(xiàn)魚腥草能夠改善糖尿病腎損害，調(diào)節(jié)脂代謝，改善IR。2.2.6其他成分研究還發(fā)現(xiàn)一些多元醇(牛彌菜醇A)、含硫的小分子氨基酸(牛磺酸)、多肽類物質(zhì)(苦瓜降糖多肽PA)、茶多酚、茶色素等在降血糖、改善胰島素抵抗方面也有一定的效果REF_Ref17238\r\h[34]。2.3中藥復(fù)方在中醫(yī)治療糖尿病IR的研究中，中成藥治療IR是不可或缺的環(huán)節(jié)，近年來，有關(guān)治療T2DMIR的中成藥不斷涌現(xiàn)，且通過大量醫(yī)學(xué)實驗及臨床觀察證實療效肯定REF_Ref17280\r\h[35]。王少蓉REF_Ref17319\r\h[36]臨床觀察津力達(dá)顆粒（主要成分包括葛根、人參、黃精、蒼術(shù)、麥冬、黃連等）對糖尿病患者胰島功能的影響，結(jié)果顯示，所有患者治療6個月后，治療組總有效率為97.5%，而單純西藥對照組為87.5%，治療后FPG、2hPG、HbA1c均明顯降低，同時與胰島素敏感性有關(guān)的HOMA-IR顯著減低，而ISI明顯升高。表明津力達(dá)顆粒能有效降低糖尿病患者血糖值，優(yōu)化胰島功能，提高糖尿病患者近期與遠(yuǎn)期療效。吳寅和趙進(jìn)東REF_Ref17375\r\h[37]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方生津顆粒（天花粉、黃連、葛根、太子參、五味子、白芍組成）能顯著改善氣陰兩虛型T2DM患者中醫(yī)臨床癥狀，可有效降低患者的血糖及空腹胰島素指標(biāo)，升高餐后2hC肽水平，降低穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)，具有保護T2DM胰島β細(xì)胞功能。呼家英和湯建芬REF_Ref17417\r\h[38]研究金芪降糖片（主要成分為黃連、黃芪、金銀花等）治療T2DM患者IＲ的臨床效果，發(fā)現(xiàn)金芪降糖片可有效降低FPG、2hPG、FINS、HbA1c、膽固醇、甘油三酯、HOMA-IR，較好地改善患者的脂代謝、增加胰島素的敏感性。郭俊杰等[39,40]研究表明：益氣化濁膠囊（黃芪、女貞子、蒼術(shù)、丹參、鬼箭羽、黃精、蠶繭）能夠顯著降低KKAy小鼠模型空腹血糖和胰島素水平，降低HOMA-IR、血清三酰甘油、膽固醇水平，增加ISI。認(rèn)為其作用機制主要是由于藥物中多種成分參與到脂代謝、糖代謝、增加外周組織對葡萄糖的攝取和利用率、增加脂肪組織中胰島素受體含量等多個環(huán)節(jié)，并通過整體、細(xì)胞、分子等不同水平的作用改善機體IR。當(dāng)然，傳統(tǒng)方劑在治療糖尿病IR時也具有很好療效。張慎樞REF_Ref17535\r\h[41]應(yīng)用中藥增敏湯（川芎、地骨皮、刺猬皮、葛根、鬼箭羽、脫敏散等）。與羅格列酮作對比研究，觀察2組藥物在降血糖和提高胰島素敏感指數(shù)方面的差異，發(fā)現(xiàn)中藥增敏湯與羅格列酮有相似的降血糖和增加胰島素敏感性作用。郭春芳等REF_Ref17584\r\h[42]應(yīng)用益氣滋陰活血方治療2型糖尿病患者40例，經(jīng)過治療，觀察組患者治療總有效率為明顯高于對照組（P<0.05）；觀察組患者治療后的FBG、2hFBG、HbA1C指標(biāo)明顯優(yōu)于對照組，且生存質(zhì)量評分優(yōu)良率高于對照組，并發(fā)癥發(fā)生率低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。董方正等REF_Ref17613\r\h[43]應(yīng)用滋脾湯治療2型糖尿病52例，治療組予每日1劑，分2次口服；對照組50例予胰島素對癥治療。結(jié)果治療組總有效率為88.4%優(yōu)于對照組的76.0%，2組比較（P<0.05）。結(jié)論自擬滋脾湯治療2型糖尿病療效顯著（P<0.05）。楊衛(wèi)杰等REF_Ref17701\r\h[44]用玉消湯（白芥子、澤瀉、枳實、漢防己、僵蠶、黃芪、白術(shù)、大黃、水蛭、三棱、莪術(shù)等）治療2型糖尿病IR，有效率為90.91%，方中白芥子、枳實化痰消積、理氣散結(jié)為君藥;澤瀉、漢防己利濕化濁為臣藥;黃芪、白術(shù)益氣健脾，僵蠶、大黃、水蛭、三棱、莪術(shù)活血化瘀、軟堅散結(jié)為佐使，諸藥合用共奏健脾化痰利濕、理氣活血祛瘀之功。閆玲玲等REF_Ref17665\r\h[45]用祛胰抵方治療2型糖尿病IR，君藥以黃芪、人參、生地黃，重在補脾益氣養(yǎng)陰;臣藥以玄參、黃精、玉竹養(yǎng)陰潤燥生津以除煩渴，茯苓健脾利水滲濕，蒼術(shù)燥濕健脾祛痰，且可防諸藥滋膩生痰;佐以黃連清胃火，水蛭、蜈蚣祛瘀通絡(luò)，可明顯減輕患者的IR指數(shù)，升高胰島素敏感指數(shù)，降低血糖、糖化血紅蛋白等指標(biāo)。王永剛等REF_Ref17747\r\h[46]研究四黃降糖顆粒（黃芪、生地黃、黃連、大黃鬼箭羽）對2型糖尿病IR大鼠模型的降糖作用，發(fā)現(xiàn)四黃降糖顆粒有增強胰島素敏感性和改善IR的作用。遲秀娥等REF_Ref17786\r\h[47]察清熱祛濁膠囊（桑白皮、黃連、知母、枳實、澤瀉、茯苓、大黃、紅花、川牛膝、山藥）對2型糖尿病合并代謝綜合征患者IR的影響，發(fā)現(xiàn)清熱祛濁膠囊與吡格列酮合用較單用吡格列酮療效顯著，能明顯降低血糖、血壓、HOMA-IR及調(diào)節(jié)血脂，這些作用可能均通過改善IR而實現(xiàn)。葛鵬玲等REF_Ref17822\r\h[48]觀察花旗澤仁（西洋參、薏苡仁、澤瀉等）對IR大鼠胰島素敏感性的影響，發(fā)現(xiàn)花旗澤仁顯著降低了血清FBG、FINS水平，升高了胰島素敏感指數(shù)，說明花旗澤仁可以提高胰島素敏感性而改善2型糖尿病IR。朱志章等REF_Ref17868\r\h[49]通過觀察溫臟扶正祛邪方聯(lián)合西藥降糖藥對2型糖尿病IR證屬虛寒者的作用，主方:紅參、制附子、干姜、桂枝、杏仁、吳茱萸、黃芪、茯苓、白術(shù)、大棗、生姜，結(jié)果顯示治療組無論是在降糖方面還是在改善IR方面，都有確切療效。仲懷中REF_Ref17910\r\h[50]運用榛黃解毒通絡(luò)方（基本方:榛花、大黃、地黃、黃連、人參、丹參）加減治療代謝綜合征52例，除濕降濁、益氣通絡(luò)、扶正抗毒，取得滿意療效。吳深濤REF_Ref17956\r\h[51]認(rèn)為糖尿病的IR系因腎虛、少陽不利兼瘀濁的病理變化，治療須以益腎化瘀、疏利少陽為主，并以瓜蔞瞿麥丸合大柴胡湯化裁治療取得滿意療效，基礎(chǔ)方藥由天花粉、山藥、茯苓、附子、瞿麥等組成，水煎服，2次/日。此外，張一嬌REF_Ref17992\r\h[52]觀察丹梔逍遙散（當(dāng)歸、白芍、白術(shù)、柴胡、茯苓、煨姜、薄荷、牡丹皮、梔子、甘草）對2型糖尿病患者IR的影響，發(fā)現(xiàn)治療組胰島素敏感指數(shù)、穩(wěn)態(tài)模型IR指數(shù)較對照組有顯著改善，說明丹梔逍遙散可以顯著增強2型糖尿病患者胰島素的敏感性而改善IR。3總結(jié)中藥治療糖尿病在幾千年的理論實踐和臨床實踐中積累了豐富的經(jīng)驗，在治療糖尿病中具有明顯優(yōu)勢，而現(xiàn)代藥理研究也證明中藥可以通過多途徑、多靶點降低血糖。一些中藥的降糖作用機制已然明確，但依舊有不少的藥物降糖機制及降糖成分不明確，甚至還有可能疏忽遺漏某些中藥的潛在降糖作用。今后，中藥在抗2型糖尿病胰島素抵抗中的研究將會有很長的一段路程，各學(xué)者應(yīng)抓住機會并迎接挑戰(zhàn)，為糖尿病患者帶來福音。參考文獻(xiàn)汪會琴,胡如英,武海濱.2型糖尿病報告發(fā)病率研究進(jìn)展[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2016,28(1):37-57.李秀鈞.代謝綜合征(第2版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.李娜,胡正芳,江振洲,等.中藥抗糖尿病研究進(jìn)展[J].藥學(xué)與臨床研究,2011,19(4):343-346王海焱,劉銅華.中藥復(fù)方治療2型糖尿病胰島素抵抗的研究[J].西部中醫(yī)藥,2017,30(5):137-140.李娟,陳玲,張曉琳,等.紅景天、蛹蟲草、大黃配伍治療代謝綜合征的實驗研究—改善胰島素抵抗作用[J].中國中藥雜志,2012,37(11)1614．江南,劉銅華.胰島素抵抗的中醫(yī)病機探討[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2006,12(9):691．朱友文,宋燦,霍海如,等.中藥在2型糖尿病中的治療和胰島素抵抗中的研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥,2015,10(1):135-137.紀(jì)云西,蔣歷.胰島素抵抗的中醫(yī)病機實質(zhì)探析[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,10(3):23-24．王智明,魏子孝.從肝論消渴(糖尿病)的理論探討[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,1999,5(4):34-35.施亞熊.肝臟胰島素抵抗[J].中華糖尿病雜志,2010,2(4):308-309.徐麗君,曾凡鵬,陸付耳,等.補腎通脈方對2型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素受體表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2003,23(4):201．龍新勝,鄭曉東.淺析代謝綜合征的中西醫(yī)病因病機[J].天津中醫(yī)藥,2008,25(1):32-33.田曉慧.中藥在治療2型糖尿病胰島素抵抗中的作用[J].中國實用醫(yī)藥,2013,8(33).趙軒,高彥彬.改善胰島素抵抗的單味中藥成分和機制研究[J].世界中醫(yī)藥,2013,8(7):840-843．李宗友.胡蘆巴抗糖尿病和降膽固醇作用[J].國外醫(yī)學(xué)中醫(yī)中藥分冊,1999,21(4):9．程秀珍,劉玉坤,劉洪琪,等.葛根、丹參、大黃對2型糖尿病大鼠模型胰島素抵抗的影響[J].中華實用中西醫(yī)雜志,2007,20(17):1525-1527．喬琳琳,黃飛，閆小光,等.黃連煎劑對代謝綜合征大鼠模型骨骼肌AMPK表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(1):145-148．鄭琳穎,潘競鏘,呂俊華.白芍總苷對脂肪肝大鼠增強胰島素敏感性及抗脂肪肝作用[J].中國中藥雜志,2008,33(20):2385．朱榮強，陳妍杰，陳小燕,等.黃芪注射液改善60例胰島素抵抗臨床觀察[J].海峽藥學(xué),2011,23(5):117-118．WangQM,LiuC,ZhaoZP,etal.StudyofScreeningandeffectsofef-fect