hplc法測定柳豆葉中黃酮類成分牡荊苷的含量

hplc法測定柳豆葉中黃酮類成分牡荊苷的含量

柳豆葉，又名木豆葉，是豆科植物canatuscanantimerrisp的干燥葉子。該藥是臺州市政協委員、尚天?？茖W技術進步獎獲得者、我院著名的骨傷科教授孫捷院長最擅長使用的中藥,而且用量較大,未發(fā)現毒副作用,臨床效果顯著。柳豆葉主要分布在我國海南、廣東、廣西、福建及臺灣等省區(qū)。柳豆葉味甘,性平,歸肝、脾、腎經。具有清熱解毒,活血化瘀,補腎健骨,消腫止痛,祛腐生肌的功能,柳豆葉具有植物雌激素,有抗骨丟失的作用,卻沒有雌激素的不良反應,具有治療骨傷感染,股骨頭壞死,骨質疏松等作用。近年來,用柳豆葉治療外傷和燒傷感染及褥瘡等取得了較好的療效,其中黃酮類成分牡荊苷是主要成分,為了更好地控制柳豆葉的質量,我們采用HPLC法對柳豆葉中牡荊苷進行定量分析,作為柳豆葉質量控制指標之一。1儀器、藥品和藥品HP-1100高效液相色譜儀(安捷倫);二極管陣列檢測器(DAD);十萬分之一BS423S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);KQ-500型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。100-200目硅膠由青島海洋化工分廠提供(批號:0061510);牡荊苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供(批號111687-200501);柳豆葉購自臺州市博愛醫(yī)院中藥房,并經臺州市食品藥品檢驗所鑒定為豆科植物Cajanuscajan(L.)Millsp.干燥葉。甲醇為色譜醇,其余試劑均為分析純。2方法和結果2.1洗脫條件及檢測波長色譜柱為HypersiolODS2C18柱(250nm×4.6nm,5);流動相為甲醇:1%醋酸,采用梯度洗脫,0～20nin,甲醇:1%醋酸(25∶75),20min后,甲醇:1%醋酸(30∶70);流速:1.0mL·min-1;檢測波長:洗脫程序(見表1);流速為1.0mL·min-1;檢測波長為339nm。2.2對照溶液的制備精密稱取牡荊苷對照品2.61mg,置25mL量瓶中,用甲醇超聲溶解并稀釋至刻度,備用。2.3供試品溶液的制備取柳豆葉適量,研細,精密稱取2g,加入甲醇50mL,充分振搖,超生處理(功率500W,頻率56KHz)60min,濾過,藥渣和濾紙用甲醇15mL分別洗滌,合并濾液和洗液,蒸干,殘渣加甲醇適量使溶解,與1g硅膠拌樣,過硅膠柱(100～200目,內徑1.5cm,從下至上,依次為:硅膠3g、拌樣硅膠、硅膠0.5g),先用三氯化鐵-甲醇(10∶1)30mL洗脫,棄去洗脫液,再用三氯化鐵-甲醇(3∶1)30mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘渣加甲醇2mL使溶解,作為供試品溶液。2.4標準曲線的繪制分別精密稱取2.2項下對照品溶液1mL,2mL,3mL,4mL,5mL,置5mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,分別取5μL注入高效液相色譜儀中,按上述色譜條件測定,測定結果以進樣量(μg)為橫坐標,以色譜峰峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程為:Y=39.32+2467.05X,r=0.9994,表明牡荊苷在0.1044～0.5220μg范圍內呈良好的線性關系。2.5精密度實驗精密吸取牡荊苷對照品5μL,重復進樣5次,平均峰面積積分值為828.24,RSD為0.59%,表明精密度良好。2.6樹葉片樹下株分布對同一供試品溶液,分別于0,2,4,8,24h內進樣,結果測得牡荊苷的平均峰面積積分值為480.66,RSD=1.21%,表明牡荊苷在24h內較穩(wěn)定。2.7重復性試驗取同批樣品5份,按供試品溶液的制備及測定向下方法平行試驗,測得樣品中牡荊苷的含量為0.478mg·g-1,RSD=2.43%,表明重復性較好。2.8標準物質回收率試驗精密稱取已知含量的本品粉末約1.05g,分別精密加入一定量的對照品,按供試品溶液的制備及樣品測定向下操作(見表1)。2.9柳豆葉、牡丹花、荊苷含量測定精密吸取2.2項下對照品溶液和供試品溶液各5μL,分別注入液相色譜儀中,測定峰面積,按外表法計算含量(見圖1)。柳豆葉樣品測定結果為:批號120302、120306、120309、120401、120403測定牡荊苷含量分別為:0.493mg·g-1、0.480mg·g-1、0.474mg·g-1、0.459mg·g-1、0.478mg·g-1。平均值為0.477mg·g-1、RSD:2.79%。3檢測波長的選擇柳豆葉的黃酮類成分牡荊苷甲醇液經紫外掃描在268nm和339nm波長處有最大吸收,339nm波長的響應值大于268nm,故選擇339nm作為檢測波長。經流動相篩選,采用甲醇-1%醋酸