改良馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的研究

改良馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的研究

pda-motata阻礙劑是馬蹄葡萄糖培養(yǎng)基的縮寫，即potata阻礙劑。這是一種固體半合成培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基是一種運用十分廣泛的培養(yǎng)基,適宜培養(yǎng)酵母菌、霉菌及蘑菇等真菌。在食品安全國家標準GB4789.15-2010中,馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基可用于檢測食品中的酵母菌含量。PDA培養(yǎng)基使用廣泛,歷史深遠,關于PDA培養(yǎng)基改進的研究較少。傳統(tǒng)PDA培養(yǎng)基的制作方法是:稱取200g馬鈴薯,洗凈去皮切成小塊,加水1000mL煮沸20min,用紗布過濾,補足水分至1000mL,根據(jù)實驗需要加葡萄糖和瓊脂,溶化后再分裝滅菌待用。傳統(tǒng)的做法存在著原料浪費嚴重、操作較為繁瑣與耗時長、不同批次培養(yǎng)基之間差別較大等問題。實驗通過對PDA培養(yǎng)基在制作方法上進行改進,舍棄耗時長的馬鈴薯煮沸再過濾的方式,而采用馬鈴薯打漿的方式,力圖達到簡便工序,節(jié)省原料,提高PDA培養(yǎng)基質(zhì)量,并切實提高該培養(yǎng)基酵母檢出率的目的。1材料和方法1.1材料、培養(yǎng)基啤酒酵母,膜醭畢赤酵母:西南大學食品科學學院微生物實驗室保存;馬鈴薯、紅提、蘋果、蛋糕:購于重慶市北碚區(qū)永輝超市;氯霉素:北京鼎國昌盛生物技術公司;PDA培養(yǎng)基:青島海博生物技術公司;葡萄糖、瓊脂、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2a.企業(yè)bs-4g培養(yǎng)MJ-25BM05C攪拌機:廣東美的精品電器制作有限公司;HH·BII·600-5型電熱恒溫箱:上海躍進醫(yī)療器械廠;BS-4G振蕩培養(yǎng)箱:金壇市富華儀器有限公司;TOMYES-315型高壓滅菌鍋:日本TomyDigitalBiology公司;SW-CJ-1F醫(yī)用型潔凈工作臺:中日合資蘇州安泰空氣技術有限公司;CH-8606型電子天平:瑞士天平儀器有限公司;UV-2450型紫外分光光度計:日本島津公司。1.3培養(yǎng)基制備方法1.3.1n打漿、灌裝、冷卻馬鈴薯洗凈去皮→稱取切塊→加適量水煮沸2min→打漿1min~2min→沖洗打漿機并定容到1000mL→加入葡萄糖20g,瓊脂15g→溶化分裝,121℃高壓滅菌20min待用。1.3.2預處理將馬鈴薯洗凈去皮,稱取200g切成小塊,加水1000mL煮沸20min,用紗布過濾,補足水分至1000mL,加入葡萄糖20g,瓊脂15g,溶化后分裝,121℃高壓滅菌20min待用。1.3.3產(chǎn)品方法按照說明書使用,加熱溶化后分裝,121℃高壓滅菌20min待用。1.3.4葡萄糖溶液制備溶解10g酵母膏,20g蛋白胨于900mL水中121℃高壓滅菌20min,將20g葡萄糖溶解于100mL水中,115℃高壓滅菌15min,最后將兩者混合使用。1.3.5菌種,6.2o玉米粉60g,KH2PO43g,維生素B1100mg,蔗糖10g,MgSO4·7H2O1.5g,水1000mL,121℃高壓滅菌30min,維生素B1單獨滅菌15min后另加。1.4實驗方法1.4.1培養(yǎng)基的設置將啤酒酵母和膜醭畢赤酵母接種于100mLYPD培養(yǎng)基中,在100r/min、28℃條件下活化24h。各吸取3mL菌液,用血球計數(shù)板法計其每毫升含菌數(shù),確定最佳的稀釋倍數(shù)。設置馬鈴薯濃度分別為40g/L、70g/L、100g/L、130g/L、160g/L的P1培養(yǎng)基為實驗組,P2培養(yǎng)基和市售PDA培養(yǎng)基為對照組。參照GB4789.15-2010,將2種酵母菌各稀釋合適的倍數(shù),吸取1mL菌液加入滅菌的培養(yǎng)皿中,倒入P1培養(yǎng)基、P2培養(yǎng)基以及市售的PDA培養(yǎng)基20mL,搖勻后靜置待瓊脂凝固,置于28℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng),5d后觀察菌落生長情況同時測量菌落大小,綜合分析得出最佳的馬鈴薯濃度。1.4.2生長曲線測定生長曲線測定:以啤酒酵母為實驗菌種,采用光電比濁法對酵母菌的生長進行測定。在500mL的錐形瓶中裝入300mLP1培養(yǎng)基為實驗組,裝入300mLP2培養(yǎng)基為對照組(都不須添加瓊脂),121℃高壓滅菌20min,然后從試管中接入啤酒酵母,在30℃、120r/min條件下培養(yǎng)。將紫外分光光度計調(diào)到波長560nm處,預熱30min,以未接種的培養(yǎng)基做空白對照。每隔4h吸取10mL培養(yǎng)基,測定其吸光度值。以時間為橫坐標,吸光度為縱坐標,制作生長曲線。酵母菌發(fā)酵力測定:采用CO2失重法來測定發(fā)酵性能。將啤酒酵母分別在P1培養(yǎng)基和P2培養(yǎng)基中活化,取25mL對數(shù)期的菌液接入250mL玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基中,并稱量首重。在30℃、120r/min條件下培養(yǎng),每隔12h稱一次瓶重,計算重量損失。以CO2失重量為縱坐標,時間為橫坐標,制作發(fā)酵曲線。1.4.3紅提蘋果醬和蛋糕中酵母菌的檢測結果參照GB4789.15-2010,設置國標培養(yǎng)基為對照組,改進后的培養(yǎng)基為實驗組,分別檢測紅提﹑蘋果醬和蛋糕中的酵母菌數(shù),比較2種培養(yǎng)基在酵母菌檢出率上的統(tǒng)計學差異。1.4.4處理數(shù)據(jù)運用Excel和t檢驗法,對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。2結果2.1培養(yǎng)基的生長將膜醭畢赤酵母和啤酒酵母在YPD培養(yǎng)基中活化后,采用血球計數(shù)板法計得2種菌液含菌濃度分別為8.4×107個/mL和6.8×106個/mL,故確定稀釋倍數(shù)確定為106倍與105倍。馬鈴薯濃度分別為40g/L、70g/L、100g/L、130g/L、160g/L的P1培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基按照1.4.1的方法接種后,置于28℃的生化培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)5d,實驗組和對照組觀察記錄見表1、表2。膜醭畢赤酵母是一種新發(fā)現(xiàn)的拮抗酵母菌,分布廣泛,具有較強的抗菌防腐作用和抗逆能力。其生長較快,在28℃培養(yǎng)5d菌落最大可達到4mm以上。由表1可知,馬鈴薯濃度為100g/L和130g/L時,直徑>2mm的菌落可達到20.1%和20.9%。啤酒酵母生長緩慢,培養(yǎng)到期后菌落較小,實驗組和對照組菌落大小均勻,直徑都在2mm以內(nèi),相互之間沒有明顯的差異性。在2組實驗中,市售PDA培養(yǎng)基所生長的菌落都是最小的。因為P1培養(yǎng)基是使用馬鈴薯全漿,當馬鈴薯濃度太高時,培養(yǎng)基中會出現(xiàn)絮狀懸浮物,影響培養(yǎng)基的透明度,從而影響觀察。當馬鈴薯濃度達到130g/L時,懸浮物可影響菌落的觀察。結合表1和表2數(shù)據(jù),確定P1培養(yǎng)基馬鈴薯的最佳濃度為100g/L。2.2結果表明，公母菌在性能試驗中的綜合結果2.2.1酵母菌的生長據(jù)2.1結果,實驗組培養(yǎng)基(P1培養(yǎng)基)采用100g/L的馬鈴薯全漿、而對照組(P2培養(yǎng)基)采用的是200g/L的馬鈴薯煮沸過濾的形式,可知兩者只有營養(yǎng)成分濃度上的差別,基本營養(yǎng)物質(zhì)種類差別不大。將實驗組和對照組接種完畢后開始計時,其生長曲線見圖1、圖2。酵母菌的生長大致分為遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定器和衰亡期。由圖1可知,前30h菌種處于遲滯期,并且試驗組和對照組沒有明顯差別。此時期菌種對培養(yǎng)基變化較為敏感,處于新陳代謝調(diào)整期,此時間較長,可能與啤酒酵母是直接從試管中接入有關。30h后菌體適應了新環(huán)境后,開始快速繁殖,試驗組和對照組均進入長達18h的對數(shù)期,增長規(guī)律基本相似。只是對照組增長趨勢略顯平緩,最高點OD值為0.605低于實驗組最高點的OD值0.717?？芍獙嶒灲M可以被酵母菌利用的營養(yǎng)物質(zhì)濃度較高,使酵母菌在對數(shù)期代謝活躍生長繁殖更快,而對照組雖具有相同的營養(yǎng)物質(zhì)但其濃度較實驗組低,酵母菌繁殖速度低于實驗組。2.3co失重量和發(fā)酵速率啤酒酵母在P1、P2培養(yǎng)基中活化后,取培養(yǎng)40h的菌液以10%的接種量接入玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基,表3與圖3是啤酒酵母在120h里的CO2的失重量和發(fā)酵速率曲線。從表3可以看出,在120h內(nèi)試驗組產(chǎn)生的CO2總量多于對照組,通過F檢驗,在顯著性水平α=0.05下,n=10,F=0.94,查表得F0.05/2,(9.9)=4.03,故p>0.05,即在α=0.05下2組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學差異,即啤酒酵母在P1、P2培養(yǎng)基中活化后,發(fā)酵力沒有發(fā)生顯著性差異。2.4表1與表2試驗結果使用改進后的培養(yǎng)基與國標GB4789.15-2010中的培養(yǎng)基,檢測不同樣品中的酵母菌,其結果見圖2與表4。利用配對設計的t檢驗法來檢驗國標培養(yǎng)基與改良培養(yǎng)基在酵母菌檢出率上的統(tǒng)計學差異,自由度v=2,t=2.03,查表得t0.1,2=1.886,知p<0.10,所以在α=0.10的情況下,改良培養(yǎng)基與國標培養(yǎng)基在酵母菌檢出率上有顯著性差異。3改良型培養(yǎng)基的制備馬鈴薯營養(yǎng)豐富,約含16.5%的碳水化合物,1.5%~