紹興黃酒機(jī)制生麥曲和熟麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的電泳分析

紹興黃酒機(jī)制生麥曲和熟麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的電泳分析

曲酒是中國黃酒的特點(diǎn)和精髓，也是中國古代的重要發(fā)明之一。酒曲為黃酒釀造提供了各種酶類,主要是淀粉酶和蛋白酶。黃酒生產(chǎn)用曲分為大曲(麥曲、麩曲和米曲等)和小曲(白藥和黑藥)兩種,統(tǒng)稱為糖化發(fā)酵劑。麥曲中的微生物主要包括各類絲狀真菌、細(xì)菌和酵母菌,這些微生物在黃酒的發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用。由于原料、制曲工藝的不同,不同種類的麥曲在微生物群落結(jié)構(gòu)上會(huì)存在一定的差異,導(dǎo)致麥曲中形成的酶系組成不同,最終影響黃酒的品質(zhì)。機(jī)制生麥曲是以小麥為原料,粉碎后拌曲,機(jī)器壓塊成型,經(jīng)自然接種堆放而成的;熟麥曲是原料小麥粉碎后,蒸熟,接種米曲霉,通風(fēng)培養(yǎng)而成。在紹興黃酒的現(xiàn)代機(jī)械化生產(chǎn)工藝中,為了減少麥曲用量,提高酶活力,提高原料利用率,使用生麥曲的同時(shí)也常常添加一定比例的熟麥曲。本實(shí)驗(yàn)室前期已對紹興黃酒機(jī)制麥曲中的真菌群落做過較為系統(tǒng)的研究。李旺軍采用培養(yǎng)法結(jié)合免培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)成品麥曲中所包含的真菌主要是Absidiacorymbifera、Saccharomycescerevisiae、Rhizopusoryzae、Rhizomucorpusillus、Aspergillusoryzae、Candidatropicalis、Emericellanidulans、Clavisporalusitaniae、A.fumigatus、A.niger、R.microsporus、Pichiaguilliermondii和P.anomala。變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis)技術(shù)最初由Fisher和Lerman發(fā)明用來檢測DNA的點(diǎn)突變。Muyzer將PCR-DGGE技術(shù)首次應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)的研究,并且證實(shí)該項(xiàng)技術(shù)在研究微生物多樣性方面具有明顯的優(yōu)勢。近年來,很多學(xué)者利用PCR-DGGE技術(shù)對不同樣品進(jìn)行了微生物多樣性的分析,包括對土壤、活性污泥、大醬、飲用水、白酒大曲、糟醅、酒醅和腸道菌群等樣品的研究,結(jié)果表明,該分子生物學(xué)技術(shù)在揭示微生物多樣性、種群差異等方面具有一定的優(yōu)越性。它不依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)過程,縮短了樣品的分析時(shí)間,還可以顯示樣品中不可培養(yǎng)微生物的信息。截至目前,尚未見利用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)研究黃酒麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道。本研究建立了利用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)PCR-DGGE,分析紹興黃酒麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)條件,并成功鑒定了機(jī)制生麥曲和熟麥曲中的細(xì)菌種類。研究結(jié)果將豐富對紹興黃酒麥曲中細(xì)菌群落的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步理解細(xì)菌在黃酒發(fā)酵中的作用奠定一定的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株、儀器和檢測設(shè)備機(jī)制生麥曲、熟麥曲樣品紹興某黃酒廠;PCR所用試劑大連寶生物工程有限公司;SYBRGreenⅠ北京優(yōu)尼康生物科技有限公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺南京生興生物技術(shù)有限公司。DCode通用突變檢測系統(tǒng)、GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)美國BIO-RAD公司;FRESCO17微型冷凍離心機(jī)賽默飛世爾科技公司;TC-25/HPCR基因擴(kuò)增儀杭州博日科技有限公司等。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1從麥曲樣本中提取微生物總dna1.2.216srdna的pcr擴(kuò)增1.2.2.srrna片段的擴(kuò)增用通用引物27F、1490R進(jìn)行16SrDNA片段的擴(kuò)增,F341-GC、R518進(jìn)行16SrDNAV3區(qū)片段的擴(kuò)增。引物序列如下:1.2.2.pcrpcr-pcrdntp、rtaq酶5u/l25μL反應(yīng)體系:10×buffer2.5μL,dNTP2.0μL,引物各1.0μL,模板0.5μL,rTaq酶(5U/μL)0.5μL,無菌雙蒸水補(bǔ)足25μL。1.2.2.pcr反應(yīng)程序采用嵌套PCR的方法,即第一步先擴(kuò)增16SrDNA全長,第二步以16SrDNA全長為模板擴(kuò)增16SrDNAV3區(qū)。第一步PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min,95℃變性1min,50℃退火1min,72℃延伸1min30s,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。第二步PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4min,94℃變性45s,55℃退火45s,72℃延伸45s,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.316srdnav3級硬化板層電泳dgge1.2.3.聚丙烯酰胺凝膠的電泳利用垂直電泳確定DGGE分析時(shí)的變性劑梯度范圍。使用梯度混合器,配制變性劑梯度范圍為20%~80%(100%的變性劑濃度為7mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠,凝膠濃度為8%。電泳條件:電泳溫度60℃,電壓150V,電泳時(shí)間4h。電泳結(jié)束后用SYBRGreenⅠ染色45min,染色結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。1.2.3.電泳溫度和時(shí)間范圍使用梯度混合器,配制已經(jīng)優(yōu)化好的聚丙烯酰胺凝膠的變性劑梯度范圍,凝膠濃度為8%。電泳溫度60℃,電壓150V,電泳過程中,以一定的時(shí)間間隔進(jìn)行上樣。電泳結(jié)束后用SYBRGreenⅠ染色45min,染色結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。1.2.4pcr擴(kuò)增ssr用無菌小刀將DGGE凝膠上的優(yōu)勢條帶割下后,放到無菌離心管中,加入100μL無菌水,4℃過夜。取其上清液作為模板,用不帶GC夾的引物F341、R518進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增程序同上。把重新擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中,涂布到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑選陽性克隆子,按照上面的程序和條件擴(kuò)增,再次進(jìn)行DGGE電泳驗(yàn)證,與原割膠條帶對應(yīng)的陽性克隆子即為正確的克隆子。1.2.5檢出限公司測序結(jié)果在genba將割膠條帶比對正確的陽性單克隆送上海生工生物工程有限公司測序,獲得的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(/Blast.cgi)進(jìn)行相似性檢索。2結(jié)果與分析2.1變性劑濃度對dna片段遷移速度的影響通過垂直電泳能夠確定適宜的變性劑梯度范圍。DGGE垂直電泳即為電泳方向和變性劑梯度方向垂直,凝膠中變性劑的濃度從左到右逐漸增大,加樣孔是一個(gè)占整個(gè)凝膠寬度的大孔(與梯度方向平行)。在變性劑低濃度邊,DNA片段以雙鏈形式沿著電泳方向遷移,遷移速度較快。在變性劑高濃度時(shí),DNA片段發(fā)生部分解鏈,沿著電泳方向遷移時(shí),速度較慢。在凝膠的中間區(qū)域,變性劑濃度接近DNA片段的解鏈溫度,此時(shí)DNA片段部分解鏈,遷移速率急劇變化,故圖譜中會(huì)出現(xiàn)“S”形曲線。分析圖1和圖2可得出,機(jī)制生麥曲和熟麥曲的變性劑梯度范圍為50%~65%和40%~60%較佳。圖1中橫貫于“S”形曲線陡峭部分的亮線可能是PCR擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生的單鏈DNA。2.2電泳時(shí)間的影響時(shí)間間歇(Time-travel)法,即每隔一定的時(shí)間進(jìn)行一次上樣,使樣品的電泳時(shí)間呈現(xiàn)一定的梯度,用以在電泳結(jié)束后根據(jù)最終的電泳圖譜確定最佳的電泳時(shí)間。電泳時(shí)間較短時(shí),條帶未完全分離,影響圖譜的分辨效果。電泳時(shí)間延長的同時(shí)條帶數(shù)目也逐漸增加。但電泳時(shí)間較長時(shí),會(huì)有部分條帶跑出凝膠,甚至條帶彌散及DGGE凝膠中的變性劑梯度發(fā)生改變。分析圖3和圖4可以確定機(jī)制生麥曲的電泳時(shí)間為5~5.5h,熟麥曲的電泳時(shí)間為4.5~5h較佳。2.3不同麥曲中細(xì)菌群落的組成根據(jù)上述摸索建立的較佳電泳條件:機(jī)制生麥曲的變性劑梯度范圍為50%~65%,電泳時(shí)間為5~5.5h;熟麥曲的變性劑梯度范圍為40%~60%,電泳時(shí)間為4.5~5h,對兩種麥曲樣品進(jìn)行DGGE分析,獲得的電泳圖譜如圖5和圖6所示。電泳圖譜中不同位置的條帶代表了不同種屬的細(xì)菌;條帶的熒光強(qiáng)度反映了該種細(xì)菌的豐度,條帶越亮,表明該種細(xì)菌的相對含量可能越大。圖譜中機(jī)制生麥曲的條帶數(shù)量明顯多于熟麥曲的條帶數(shù)目,說明機(jī)制生麥曲中的細(xì)菌種類多于熟麥曲中的細(xì)菌種類。為明確紹興黃酒機(jī)制生麥曲和熟麥曲中細(xì)菌群落的種屬組成,DGGE電泳結(jié)束后,進(jìn)一步對各自的主要優(yōu)勢條帶進(jìn)行了切膠回收、T-A克隆、DNA測序及相似性檢索。測序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫比對后,相似率均大于98%,比對結(jié)果顯示兩種麥曲中均存在糖多孢菌屬及腸桿菌屬的細(xì)菌。糖多孢菌屬的許多菌種可以產(chǎn)生重要的生物活性物質(zhì),如各種酶類、抗生素、維生素等,如MasahiroNakao等就從一株糖多孢菌(Saccharopolysporarectivirgula)中分離純化到了耐熱半乳糖苷酶。該屬細(xì)菌在黃酒發(fā)酵過程中的具體作用還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)還檢測到了一株致病性病菌Clavibactermichiganensis,該病菌對黃酒生產(chǎn)造成的潛在危害需要進(jìn)一步的評價(jià)。機(jī)制生麥曲電泳圖譜中位于不同位置的條帶E和H的最相似菌株相同,原因可能是16SrDNA多拷貝序列的不均一性。2.4系統(tǒng)發(fā)育樹的建設(shè)用軟件MEGA5對測序結(jié)果和GenBank中相關(guān)種屬代表菌株的16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果如圖7所示。3pcr-dage分析DGGE電泳條件的選擇在整個(gè)實(shí)驗(yàn)的分析過程中起著非常重要的作用,電泳條件的優(yōu)劣直接關(guān)系到樣品條帶分離的好壞,繼而影響后續(xù)的分析工作。在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)過程中,僅靠設(shè)備說明書和一些參考文獻(xiàn),不易掌握實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié),實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的樣品優(yōu)化自己的電泳條件。本實(shí)驗(yàn)中,利用垂直電泳和時(shí)間間歇法確立了DGGE分析紹興黃酒機(jī)制生麥曲和熟麥曲的變性劑梯度范圍和電泳時(shí)間。機(jī)制生麥曲的變性劑梯度范圍為50%~65%,電泳時(shí)間為5~5.5h;熟麥曲的變性劑梯度范圍為40%~60%,電泳時(shí)間為4.5~5h。本研究證明了PCR-DGGE技術(shù)是一種能夠快速分析黃酒麥曲中細(xì)菌群落的方法。通過PCR-DGGE對紹興黃酒機(jī)制生麥曲和熟麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,可以發(fā)現(xiàn)熟麥曲中細(xì)菌種類比機(jī)制生麥曲少,且熟麥曲鑒定出的細(xì)菌種類都包含于機(jī)制生麥曲中。這可能與兩種麥曲的制作工藝和制曲時(shí)間有關(guān)。機(jī)制生麥曲的制曲時(shí)間需1個(gè)月左右,暴露在環(huán)境中的時(shí)間較長,導(dǎo)致其中含有的微生物種類較多;而熟