乳腺癌干細(xì)胞研究進(jìn)展

乳腺癌干細(xì)胞研究進(jìn)展

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的腫瘤。約有50%的乳腺癌患者經(jīng)手術(shù)治療后可治愈,其他患者在治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗,且復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。隨著人們對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究,乳腺癌干細(xì)胞日益受到重視。1乳腺癌中細(xì)胞的分化腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為,腫瘤組織中的癌細(xì)胞的生物學(xué)特性不盡相同,即腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞本身具有異質(zhì)性,其中一小群細(xì)胞數(shù)目極其稀少,分化緩慢,但其成瘤能力較強(qiáng),多具有與干細(xì)胞相似的自我更新能力和一定的分化潛能,并表達(dá)某些正常干細(xì)胞相同的細(xì)胞標(biāo)記蛋白。同樣,乳腺癌中也存在著此類(lèi)細(xì)胞,即所謂的乳腺癌干細(xì)胞(breastcancerstemcells,BCSCs),BCSCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與維持的基礎(chǔ),與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療的耐受有關(guān)。目前研究認(rèn)為只有少數(shù)BCSCs進(jìn)入細(xì)胞周期,而多數(shù)BCSCs處于靜止?fàn)顟B(tài),故BCSCs對(duì)常規(guī)的化療藥物并不敏感?，F(xiàn)有的物理、化學(xué)藥物治療手段所針對(duì)的是大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞,對(duì)腫瘤中少數(shù)的BCSCs無(wú)法達(dá)到最有效的殺滅效果,不能防止惡性腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移,而腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。2乳腺癌的樹(shù)干標(biāo)記和高發(fā)現(xiàn)2.1乳腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)乳腺癌中以CD44+CD24-/low為分子標(biāo)志物的細(xì)胞為乳腺癌干細(xì)胞(breastcancerinitiatingcells,BRCaIC)。Clarke等首次從人類(lèi)乳腺癌標(biāo)本中分離出BRCaIC,并把表達(dá)CD44、B38.1和ESA的乳腺癌細(xì)胞移植到NOD/scid小鼠體內(nèi)并生成腫瘤。Al-Hajj等以L(fǎng)inESA+CD44+CD24-/low為特異性乳腺癌干細(xì)胞,證明了表型為L(zhǎng)in-ESA+CD44+CD24-/low的細(xì)胞較表型為L(zhǎng)in-ESA-CD44+CD24+的細(xì)胞在NOD/scid小鼠體內(nèi)具有更強(qiáng)的成瘤能力。Ponti等把乳腺癌組織和乳腺癌的細(xì)胞系中分離出的CD4+CD24-CD43-進(jìn)行體外培養(yǎng),結(jié)果顯示細(xì)胞呈球狀生長(zhǎng),并過(guò)表達(dá)血管生成因子、細(xì)胞保護(hù)因子及公認(rèn)的干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4。但Abraham等用免疫雙染法檢測(cè)了136例患者石蠟組織切片,發(fā)現(xiàn)CD44+CD24-/low的比例與臨床結(jié)果無(wú)關(guān),CD44+CD24-/low比例高的乳腺癌更傾向于骨轉(zhuǎn)移,提示對(duì)BRCaIC的標(biāo)志尚需進(jìn)一步細(xì)化及深入研究。2.2wnt信號(hào)通路活化劑有證據(jù)表明與乳腺癌形成有關(guān)的信號(hào)通路,如Notch、Shh和Wnt、Hedgehog參與了調(diào)整乳腺癌干細(xì)胞自我更新的過(guò)程。乳腺干細(xì)胞高表達(dá)Notch1、Notch4及其靶基因HESR-1,Notch通路的活化導(dǎo)致了乳腺微球體的形成,卻對(duì)分化細(xì)胞無(wú)作用。Wnt蛋白是細(xì)胞間的信號(hào)分子,正常情況下,該分子調(diào)節(jié)一些器官的發(fā)育,其異常調(diào)節(jié)時(shí)則導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。研究表明,Wnt信號(hào)通路的活化可引起乳腺癌干細(xì)胞的比例增加,骨髓中Wnt表達(dá)可能同樣影響HSCs,使用高度純化的小鼠骨髓HSCs。在長(zhǎng)期的HSCs培養(yǎng)中,激活β-catenin的過(guò)度表達(dá)(一種Wnt的下游激活物)能擴(kuò)增可移植的HSCs。Liu等研究發(fā)現(xiàn),Hedgehog在乳腺癌干細(xì)胞高度表達(dá),其通道活化后乳腺微球體數(shù)量及體積均增加,同樣提示Hedgehog異常表達(dá)可導(dǎo)致乳腺癌的形成。2.3循環(huán)祖細(xì)胞鑒定ALDH1是細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化脫氫酶,可在干細(xì)胞分化早期氧化視黃醇而形成視黃酸,鼠和人類(lèi)的造血及神經(jīng)干細(xì)胞中ALDH1活性較高,Hoechst染色法和ALDH活性已被用來(lái)純化和鑒定鼠和人的造血干細(xì)胞。此外,循環(huán)祖細(xì)胞也可用ALDH活性來(lái)鑒定。另一研究顯示ALDH1的表達(dá)可能提示乳腺上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞特征。Ginestier等發(fā)現(xiàn)ALDH1活性增加的正常人和癌癥患者的乳腺上皮細(xì)胞具有干/祖細(xì)胞特性。含有高水平的ALDH1的正常乳腺上皮細(xì)胞群能形成乳腺球,從中分離的細(xì)胞能自我更新。ALDH1高活性的乳腺癌細(xì)胞可以重現(xiàn)親代腫瘤的雜合性,表明ALDH1高活性的乳腺癌細(xì)胞也包含干細(xì)胞群。Ginestier等還認(rèn)為ALDH1免疫組織化學(xué)檢測(cè)可用來(lái)鑒別乳腺干細(xì)胞。ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞定位于末端導(dǎo)管小葉單位。另一研究認(rèn)為乳腺癌干細(xì)胞定位于乳腺導(dǎo)管。在乳腺癌臨床檢測(cè)中ALDH1的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)。3乳腺癌干預(yù)的分離和發(fā)現(xiàn)3.1aldh+的臨床意義乳腺癌干細(xì)胞的成功分離是為下一步進(jìn)行乳腺癌干細(xì)胞特性研究的關(guān)鍵步驟。研究者采用各種不同途徑來(lái)分離乳腺癌干細(xì)胞,每種方法各有其利弊。目前比較成熟的方法有2種:流式分選法(fluorescence-activatedcellsorting,FACS)和磁式分選法(magneticactivatedcellsorting,MACS)。最近有研究中發(fā)現(xiàn),高ALDH活性的正常乳腺上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性,可在NOD/scid小鼠體內(nèi)形成乳球和導(dǎo)管小葉結(jié)構(gòu)。在人類(lèi)乳腺癌的異種移植中,ALDH+的細(xì)胞也具有腫瘤干細(xì)胞的特征:約占細(xì)胞總數(shù)的1%~10%,致瘤性很強(qiáng),200個(gè)ALDH+的細(xì)胞即可在NOD/scid小鼠體內(nèi)形成腫瘤,且新形成的轉(zhuǎn)移瘤中具有與原發(fā)腫瘤相同的ALDH基因表達(dá)圖譜,但2×103個(gè)ALDH-細(xì)胞也不能形成轉(zhuǎn)移瘤。此外,利用腫瘤組織的微陣列分析也發(fā)現(xiàn)ALDH+的乳腺癌臨床預(yù)后差。目前臨床上使用測(cè)定ALDH的活性為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)提供有力支持。3.1.2吸附細(xì)胞后的磁場(chǎng)MACS利用未標(biāo)記的CD分子的單克隆抗體作為一抗與單細(xì)胞懸液溫育后,再與免疫磁珠標(biāo)記的二抗結(jié)合,當(dāng)這種特異性一抗、二抗標(biāo)記的細(xì)胞懸液流過(guò)特制的永久磁鐵的磁場(chǎng)時(shí),可吸附在磁式分選柱內(nèi),再將磁式分選柱移開(kāi)磁場(chǎng)并從柱內(nèi)洗脫,從而收集干細(xì)胞。3.2乳腺癌干預(yù)的發(fā)現(xiàn)當(dāng)前,從形態(tài)學(xué)方面對(duì)乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行鑒定較為困難,只能從功能學(xué)方面進(jìn)行分析。3.2.1乳腺癌胞菌體的增殖能力即體外培養(yǎng)的乳腺癌干細(xì)胞是否呈懸浮球狀生長(zhǎng),是否具有自我更新和增殖能力以及是否具多向分化潛能。目前有研究表明:乳腺癌干細(xì)胞易呈懸浮球狀生長(zhǎng)并可連續(xù)傳代,在傳代的后期更易出現(xiàn)懸浮球狀生長(zhǎng)且增殖速度加快;此外,通過(guò)有限稀釋實(shí)驗(yàn)和亞克隆培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)所有親本腫瘤球制成的細(xì)胞懸液都再次形成腫瘤球,且與親本腫瘤球完全相同,提示乳腺癌干細(xì)胞具有自我更新和增殖能力;將乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7d左右,便不再或極少表達(dá)Nestin和CD133,而這2種標(biāo)記物現(xiàn)在普遍被認(rèn)為在干細(xì)胞或是祖細(xì)胞中表達(dá),表明了干細(xì)胞具有多向分化的潛能。但這些方法只能初步鑒定乳腺癌干細(xì)胞。3.2.2小鼠體內(nèi)重建模型即將初步鑒定出的乳腺癌干細(xì)胞在NOD/scid小鼠體內(nèi)重建模型,從而觀(guān)察其致瘤性,此種方法被認(rèn)為是目前進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞鑒定的最具說(shuō)服力的方法。3.2.3乳腺癌細(xì)胞的免疫療法美國(guó)密歇根大學(xué)綜合癌癥中心的研究人員最近又發(fā)現(xiàn)一種鑒定乳腺腫瘤干細(xì)胞新方法,這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)不僅為確定乳腺癌治療最佳方案提供了一種簡(jiǎn)單診斷方法,還強(qiáng)有力地支持了癌癥干細(xì)胞學(xué)說(shuō)。研究人員利用名為ALDEFLUOR的試劑來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中的ALDH活性。表達(dá)高水平ALDH的細(xì)胞會(huì)發(fā)出熒光并且能夠被檢測(cè)到。隨后,細(xì)胞被分選并與被染色細(xì)胞分離。在此過(guò)程中,研究人員發(fā)現(xiàn)ALDEFLUOR試劑檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的行為與干細(xì)胞相同,而檢測(cè)結(jié)果為陰性細(xì)胞則明顯不同。4乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌治療中的應(yīng)用現(xiàn)有的乳腺癌治療方法多旨在盡可能殺死或清除一切腫瘤細(xì)胞。但是對(duì)存在于腫瘤中的數(shù)量稀少的干細(xì)胞樣細(xì)胞群卻作用甚微,治療后殘存腫瘤干細(xì)胞的增殖,足以促使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。乳腺癌復(fù)發(fā)被認(rèn)為是由于非分裂的乳腺癌干細(xì)胞具有抗藥性。比如,大多數(shù)與BRCA21基因相關(guān)的乳腺癌在解除鉑類(lèi)化療藥物治療2~3個(gè)月后獲得抗鉑性。對(duì)這些腫瘤細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),與原發(fā)性腫瘤移植相比,CD29highCD-24med細(xì)胞群在鉑類(lèi)藥物難治性繼發(fā)腫瘤移植中顯著增加,從6.6%~11.0%增加至16.5%~29.2%。這表明克隆演變和乳腺癌干細(xì)胞擴(kuò)增可能是化療耐藥的一個(gè)原因。免疫療法是另一種用來(lái)消除乳腺癌干細(xì)胞群的治療方法。Li等研究顯示添加突變r(jià)h471TNF2α到MCF7亞群(乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和降低自我更新的能力。突變r(jià)h471TNF2α可負(fù)性調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞,也有可能被應(yīng)用于乳腺癌治療。Piyush等發(fā)現(xiàn)鹽霉素殺死乳腺癌干細(xì)胞的能力比普通的化療藥物如紫杉醇強(qiáng)100倍。與被紫杉醇處理過(guò)的腫瘤干細(xì)胞相比,經(jīng)過(guò)鹽霉素處理過(guò)的腫瘤干細(xì)胞被注入到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)后,成瘤幾率顯著降低,且實(shí)驗(yàn)鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度也明顯減慢。5特異性乳腺癌干細(xì)胞總之,乳腺癌干細(xì)胞理論為根治乳腺癌開(kāi)辟了新的治療途徑,腫瘤治療研究開(kāi)始以特異性乳腺癌干細(xì)胞為主要目標(biāo),即從源頭上根治腫瘤。發(fā)現(xiàn)和闡明乳腺癌干細(xì)胞增殖過(guò)程中的基因調(diào)控機(jī)理,將為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn),針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的新一代特異性強(qiáng)的抗腫瘤生物及免疫藥物有望極大地提高腫瘤的治療效果。3.1.1FACS3.1.1.er2,abcg2基因的表達(dá)三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-bindingcassettesuperfamilyGmember2,ABCG2),基因在多種來(lái)源的干細(xì)胞膜均有表達(dá),而在大多數(shù)成熟細(xì)胞中不表達(dá)。在乳腺癌干細(xì)胞中同樣高表達(dá)ABCG2,其高表達(dá)細(xì)胞高效外排DNA熒光染料Hoechst33342,從而能用流式分選出側(cè)群(sidepopulation,SP)干細(xì)胞。Patrawala等利用此法成功分離出乳腺癌干細(xì)胞。3.1.1.小鼠乳腺癌中cd49和cd2的分離純化乳腺癌干細(xì)胞可利用CD44和CD24分子來(lái)分選,