尿半胱氨酸蛋白酶抑制劑c在不同貯存條件下的穩(wěn)定性研究

尿半胱氨酸蛋白酶抑制劑c在不同貯存條件下的穩(wěn)定性研究

低分子蛋白質(zhì)是指相對(duì)分子量為5000.40的小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，血漿半衰期短。此類(lèi)尿蛋白幾乎全部從腎小球?yàn)V過(guò),在近端小管分解代謝,被腎小管重吸收。因此,臨床多利用此特性作為評(píng)價(jià)腎小管的功能損傷指標(biāo)。目前常用的指標(biāo)有:β2-微球蛋白(β2-MG,相對(duì)分子質(zhì)量11800)、α1-微球蛋白(α1-MG,相對(duì)分子質(zhì)量26100)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP,相對(duì)分子質(zhì)量22200)等。近幾年來(lái)隨著血中半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(cystatinC,CysC)作為腎小球?yàn)V過(guò)功能指標(biāo)的臨床應(yīng)用,尿CysC的臨床應(yīng)用逐漸引起關(guān)注,其特性與其他尿低分子量蛋白相似,而且其生成速度穩(wěn)定,不受炎癥因素、膽紅素、溶血、三酰甘油等影響,并與性別、年齡、肌肉量無(wú)關(guān),已有研究表明尿CysC與尿RBP的結(jié)果顯著相關(guān)(r=0.809),是反映腎小管功能敏感而特異的指標(biāo),而對(duì)于尿CysC的穩(wěn)定性未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。我們旨在通過(guò)測(cè)定不同貯存溫度、時(shí)間及pH值條件下尿α1-MG、CysC、β2-MG結(jié)果的變化,比較各指標(biāo)的穩(wěn)定性,為尿CysC的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法一、材料表面1.含量測(cè)定共收集新鮮尿液標(biāo)本24份,CysC含量為1.28~1134mg/L、β2-MG含量為1.0~8643mg/L、α1-MG含量為6.0~19.8mg/L。2.儀器MK2洗板機(jī)、MultiskanEX酶標(biāo)比色儀均為labsystem公司生產(chǎn)、AXSYM酶免疫檢測(cè)系統(tǒng)由美國(guó)雅培公司生產(chǎn)。二、方法1.cysc、2-mg及1-mg對(duì)cysc、2-mg及1-mg含量的影響分別測(cè)定24份新鮮尿液標(biāo)本pH值,再將每份標(biāo)本分成5管,1管為對(duì)照管,其余4管分別用1mol/LHCl或1mol/LNaOH調(diào)整pH值至4.0、5.0、6.0、7.0,分別檢測(cè)每份標(biāo)本CysC、β2-MG及α1-MG在不同pH值的含量。然后再將同一份標(biāo)本的每一個(gè)pH濃度(pH值為4.0、5.0、6.0、7.0)都均分成3管,第1管于4℃放置48h和1周,第2管于20℃放置24和48h,第3管于37℃放置2、4和24h,然后分別檢測(cè)尿CysC、β2-MG及α1-MG的含量。將以上不同條件時(shí)測(cè)得的尿CysC、β2-MG及α1-MG與各自對(duì)照管比較,計(jì)算其數(shù)值改變的百分比,觀察各指標(biāo)的穩(wěn)定性。2.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備采用本實(shí)驗(yàn)室建立的酶聯(lián)免疫測(cè)定方法。在聚苯乙烯微量板內(nèi)加入100μl包被液稀釋的CysC抗體(美國(guó)德靈公司),放4℃冰箱過(guò)夜,洗板5次后拍干;加入100μl封閉液4℃過(guò)夜(或37℃2h),洗板5次后拍干,可存放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ诜忾]后的微量板內(nèi)加入100μl稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(USBiological公司)和標(biāo)本,37℃孵育60min,洗板5次后拍干;加入100μl的酶標(biāo)抗體,37℃孵育45min,洗板5次后拍干;然后加入顯色劑A液、B液各50μl,37℃孵育10min;最后加入終止液50μl,450nm處比色,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算標(biāo)本濃度。3.尿2-mg試驗(yàn)美國(guó)雅培公司AXSYM檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑盒,采用微粒子酶免疫分析法,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4.尿1-mg法測(cè)定美國(guó)德靈公司BNII檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑盒,采用速率散射比濁法,實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。三、統(tǒng)計(jì)方法采用EXCEL5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果一、ph值對(duì)尿液c-i的影響pH4.0時(shí),尿CysC、β2-MG顯著減低;pH>5.0時(shí),結(jié)果趨于穩(wěn)定,但不同的pH值環(huán)境,α1-MG結(jié)果均非常穩(wěn)定,見(jiàn)表1。二、影響排尿ph、儲(chǔ)存溫度和時(shí)間的cysc結(jié)果的因素1.結(jié)果占照管結(jié)果的平均配比℃48h和1周,計(jì)算24份標(biāo)本尿CysC、β2-MG及α1-MG結(jié)果占各自對(duì)照管結(jié)果的平均百分比。在pH4.0,4℃的條件下,尿CysC、β2-MG結(jié)果顯著下降,但只要尿液pH>5.0,兩者結(jié)果便趨于穩(wěn)定,但4℃放置1周時(shí),尿CysC結(jié)果穩(wěn)定性明顯優(yōu)于β2-MG,見(jiàn)表2。2.平均配比℃24和48h,計(jì)算24份標(biāo)本尿CysC、β2-MG及α1-MG結(jié)果占各自對(duì)照管結(jié)果的平均百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pH5.0時(shí),20℃放置24和48h,尿β2-MG結(jié)果只有對(duì)照管的65%和51%,而同樣條件下尿CysC結(jié)果分別為對(duì)照管的100%和98%,明顯優(yōu)于尿β2-MG。見(jiàn)表3。3.結(jié)果占比對(duì)℃2、4和24h,計(jì)算24份標(biāo)本尿CysC、β2-MG及α1-MG結(jié)果占各自對(duì)照管結(jié)果的平均百分比。尿CysC只要pH>5.0,37℃放置24h,結(jié)果仍較穩(wěn)定,但尿β2-MG37℃放置時(shí)間必須<4h,pH值必須>6.0時(shí),才不影響檢測(cè)結(jié)果。見(jiàn)表4。尿cysc的穩(wěn)定性尿液中小分子質(zhì)量蛋白被公認(rèn)為是腎小管損傷的標(biāo)志物,并有部分尿蛋白(如RBP、α1-MG、β2-MG等)的檢測(cè)已廣泛應(yīng)用于臨床,但這一類(lèi)蛋白在尿液中的穩(wěn)定性非常重要,關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。已有相關(guān)研究證明,尿α1-MG在不同的pH值及各種儲(chǔ)存溫度條件下均非常穩(wěn)定,而最易降解的是尿β2-M。尿CysC作為一項(xiàng)新的逐漸引起關(guān)注的評(píng)價(jià)腎小管功能指標(biāo),其檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性會(huì)直接影響尿CysC在臨床的推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果證實(shí),尿α1-MG非常穩(wěn)定,不同pH值及儲(chǔ)存條件對(duì)尿α1-MG結(jié)果影響很小。而尿β2-MG非常容易降解,主要由于尿β2-MG在酸性環(huán)境時(shí),尿中的酸性蛋白酶的分解作用,β2-MG的蛋白結(jié)構(gòu)受到破壞,含量減少。而且環(huán)境溫度越高,放置時(shí)間越長(zhǎng),降解越多,只有當(dāng)尿液pH>7.0時(shí)結(jié)果才趨于穩(wěn)定。由于正常人尿液的pH值多在5.5~6.5之間,所以β2-MG較易降解,從而影響檢測(cè)結(jié)果。因此檢測(cè)前需將新鮮尿液標(biāo)本pH值調(diào)整到7.0~9.0之間,才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。而尿CysC穩(wěn)定性高,只要滿足pH≥5.0的前提條件,不同的儲(chǔ)存溫度及時(shí)間(4℃1周,20℃48h,37℃24h),其結(jié)果變化范圍都<10%,結(jié)果較穩(wěn)定,因此一般尿液標(biāo)本的pH值環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本儲(chǔ)存條件(4℃保存1周),不會(huì)影響尿CysC的檢測(cè)結(jié)果。目前盡管尿β2-MG非常不穩(wěn)定,但臨床仍然同時(shí)檢測(cè)血清及尿β2-MG,作為評(píng)價(jià)腎病患者腎臟損傷部位及程度的標(biāo)志。但在臨床應(yīng)用中需要注意的是,不僅尿β2-MG非常不穩(wěn)定,而且血清β2-MG作為評(píng)價(jià)腎功能的指標(biāo),在腫瘤、心血管、中樞系統(tǒng)、甲狀腺等疾病中都可升高,其特異性較差。血清Cys