重癥急性呼吸綜合征的發(fā)病機制及防治

重癥急性呼吸綜合征的發(fā)病機制及防治

重癥急性呼吸綜合征（ss）具有很強的傳染性，死亡率很高，引起了全世界的關(guān)注。一種新型的冠狀病毒(coronavirus)滿足了6個科赫要點(Koch’spostulates),極可能是SARS的病原體。2003年4月12日,加拿大科學家首次公布了SARS病毒Tor2的基因組序列。4月16日,WHO正式確認SARS病毒是SARS的病原體。目前SARS病情仍然十分嚴峻,世界各國正努力研究SARS病毒的生物學特征和可能的藥物防治靶點及疫苗。1病毒屬、分離細胞和克氏原螯蝦3種類型病毒,都有其特定的基因組織發(fā)生情況之一—冠狀病毒簡介及其結(jié)構(gòu)特征冠狀病毒科(Coronaviridae)成員為單鏈RNA病毒,在分類學上它們與動脈炎病毒科(Arteriviridae)同屬于巢病毒目(Nidovirales)。目前所知,它們只侵染脊椎動物,并與人類和動物的許多疾病有關(guān);自1980年在德國召開第一屆國際冠狀病毒討論會以來,日益受到醫(yī)學、獸醫(yī)學和分子生物學家的廣泛重視。這類病毒具有胃腸道、呼吸道和神經(jīng)系統(tǒng)的嗜性,特別是鼠肝炎病毒JHM毒株可以引起小鼠的脫髓鞘性腦脊髓炎,是研究人類多發(fā)性硬化病(multiplesclerosis)的良好模型。冠狀病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄機制又為分子病毒學家提供了另一種RNA拼接機制,而且它還是一個很好的外源基因的表達系統(tǒng)。根據(jù)其基因組和抗原性特征,冠狀病毒可大致分為三類:第一類來自豬等動物[如豬傳染性胃腸炎病毒(porcinetransmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)、人冠狀病毒229E];第二類來自牛、鼠等動物[如牛冠狀病毒、小鼠肝炎病毒(mousehepatitisvirus,MHV)、人冠狀病毒OC43];第三類來自雞等禽類[如火雞藍冠病毒(turkeybluecombvirus)、鳥類傳染性支氣管病毒(avianinfectiousbronchitisvirus,IBV)]。人類的冠狀病毒種類比較多,分別屬于第一類和第二類。引起普通感冒的病毒中有20%屬于冠狀病毒,主要有229E和OC43兩個抗原型,但普通感冒癥狀較輕,因此不像目前的“非典”病毒引人注目。冠狀病毒感染分布于全世界各地區(qū),在我國以及英國、美國、德國、日本、俄羅斯、芬蘭、印度等國均已發(fā)現(xiàn)冠狀病毒的存在。此類病毒對溫度很敏感,因而所引起的疾病流行多發(fā)生在冬季和早春季節(jié)。冠狀病毒也是成人慢性氣管炎患者急性加重的重要病原體,目前冠狀病毒的感染尚無特異性治療和預防手段。冠狀病毒為正義單鏈RNA病毒,復制不經(jīng)過DNA中間體。其基因組是已知的RNA病毒中最大的,約27～31kb。依病毒株不同,冠狀病毒有3或4種結(jié)構(gòu)性蛋白,即刺突蛋白S(spikeprotein),膜蛋白M(membraneprotein),小分子膜蛋白E(smallmembraneprotein),核衣殼蛋白N(nucleocapsidprotein)及血凝素酯酶HE(hemagglutininesterase/acetylesterase)(圖1)。其中S蛋白是病毒外殼成分,也是病毒和宿主細胞受體結(jié)合及病毒誘發(fā)機體產(chǎn)生抗體或細胞性免疫反應的重要因子。S蛋白屬于I型膜蛋白,在病毒的成熟過程中需經(jīng)過翻譯后加工,如糖基化、被胰蛋白酶樣蛋白酶切成S1和S2片段等。S2片段藉跨膜區(qū)錨定于膜上,而S1片段僅通過非共價鍵與S2片段連接。S1片段主要參與病毒與宿主細胞間的識別,而S2片段則在S1片段識別和結(jié)合宿主細胞受體后發(fā)生構(gòu)象改變,從而促進病毒與細胞的融合。M蛋白是負責病毒顆粒組裝的主要蛋白質(zhì),屬于Ⅲ型膜蛋白,可分為:一個大的C端體內(nèi)區(qū)(endodomain),三個穿膜片段和一個短的N端體外區(qū)(ectodomain)。E蛋白也是一種膜整合蛋白,在病毒表面的數(shù)目相對較少,由占全長2/3的高疏水性的N端(E蛋白的跨膜區(qū))和一段伸向病毒體內(nèi)的C端組成。HE僅在少數(shù)冠狀病毒表面存在,屬I型糖蛋白,含一段跨膜區(qū)和很短的體內(nèi)區(qū)。HE蛋白在成熟的病毒顆粒表面常以藉二硫鍵連接的同源二聚體形式存在,可能與病毒所引起的病理有關(guān)。SARS病毒是SARS的元兇。在加拿大科學家首次公布了SARS病毒Tor2的基因組序列后,美國、中國香港、新加坡和中國北京等相繼報道了相應SARS病毒株的基因組序列。通過比較已知冠狀病毒的基因組后發(fā)現(xiàn),SARS病毒基因組結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒相似,預測得到的主要蛋白質(zhì)有RNA復制酶(復制酶1a,1b),S、M、E、N蛋白等,但沒有HE蛋白。SARS病毒雖然外表與其他冠狀病毒類似,但從基因和蛋白質(zhì)的同源性可以看出,SARS病毒明顯不同于已知的其他三類冠狀病毒群,可能屬于新的冠狀病毒群,其S、M和N蛋白與其他冠狀病毒相對應的蛋白質(zhì)在進化關(guān)系上接近,但在某些區(qū)域與其他冠狀病毒存在相當大的差異。SARS病毒基因組中約有2/3與鼠類冠狀病毒的相關(guān)基因有“遠親”關(guān)系,另一部分則與鳥類冠狀病毒的基因有些相似。2冠狀病毒的生物學特性2.1hcov-264e病毒與宿主細胞融合的可能機制冠狀病毒的S蛋白在病毒表面以三聚體形式存在,是構(gòu)成病毒表面冠狀結(jié)構(gòu)的主要成份,也是病毒和宿主細胞受體結(jié)合并引起病毒包膜與細胞膜融合從而導致病毒入侵的主要結(jié)構(gòu)蛋白。有些冠狀病毒表面還有HE蛋白,它也能與宿主細胞表面受體9-O-acetylneuraminicacid結(jié)合,但就病毒入侵宿主細胞的要求而言,S蛋白是充足且必需的。S蛋白結(jié)構(gòu)不同,其相應宿主細胞上的受體也不相同。它是決定冠狀病毒對不同的宿主細胞嗜性的基礎。人氨肽酶N(hAPN)是人冠狀病毒229E的S蛋白的受體,而人冠狀病毒OC43卻利用細胞表面MHCI分子作為受體。APN是在腸、肺、腎等上皮細胞及神經(jīng)細胞突觸等處表達的細胞表面金屬蛋白酶,人冠狀病毒229E對神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞的侵染也是借助于S蛋白對APN的結(jié)合。APN催化活性中心的突變可導致其喪失對HCoV-229E的結(jié)合,表明結(jié)合位點在催化活性中心內(nèi)或附近,但S蛋白與APN的結(jié)合過程似乎與此酶的活性無關(guān)?？扇苄允荏whAPN可以阻止HCoV-229E病毒對宿主細胞的侵染。如前所述,HCoV-229E病毒S蛋白與hAPN結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變,從而促進了病毒與細胞的融合。對人橫紋肌肉瘤細胞有很高嗜性的HCoV-OC43利用宿主細胞的MHCI分子作為受體,干擾素γ能通過增強神經(jīng)細胞MHCI的表達提高病毒對神經(jīng)元的嗜性。小鼠肝炎病毒MHV則以癌胚抗原細胞粘附分子(CEACAM)作為受體,CEACAM和MHCI分子同屬于Ig超家族。這些結(jié)果表明冠狀病毒家族中不同成員,其宿主細胞表面的S蛋白受體可以是相關(guān)聯(lián)或無關(guān)聯(lián)的。如前所述,S蛋白識別和結(jié)合宿主細胞上的受體主要借助于其N端的S1片段,如HCoV-229E的S1片段內(nèi)的407～547殘基序列對病毒結(jié)合hAPN是必需的。除了這種蛋白質(zhì)-受體介導的細胞融合外,冠狀病毒在低溫時還可直接以膜融合方式入侵宿主細胞。冠狀病毒對宿主細胞的選擇性主要依賴于S蛋白的膜外區(qū),此區(qū)的改變常能改變病毒的宿主嗜性,例如將不能侵染小鼠的貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)的S蛋白膜外區(qū)用小鼠肝炎病毒MHV的S蛋白膜外區(qū)取代,則重組的病毒(mFIPV)就獲得了侵染小鼠的能力而不再侵染貓。一些已知冠狀病毒進入宿主細胞的受體見表1。干擾冠狀病毒的表面蛋白與其宿主細胞上受體的相互作用能阻斷病毒入侵宿主細胞,因而針對這一靶點有望開發(fā)出有效的防治冠狀病毒侵染的藥物。冠狀病毒是一種有外殼的RNA病毒,其入侵宿主細胞的方式有:1.受體介導的內(nèi)吞,這需要病毒表面S蛋白等識別并結(jié)合宿主細胞上的對應受體。它們的相互作用引起宿主細胞內(nèi)吞病毒顆粒,并形成早期內(nèi)吞體(endosome),此過程可能同樣需要成籠蛋白(clathrin)介導。早期內(nèi)吞體在宿主細胞內(nèi)進一步與溶酶體融合,通過酶解等作用裂解病毒顆粒,將病毒的基因組RNA釋放到胞內(nèi)。根據(jù)此過程對酸的敏感性又可分為:酸性依賴(如TGEV,OBLV60)和非酸性依賴(如MHV-4);2.病毒與宿主細胞膜的直接融合,這也依賴于病毒表面S蛋白等對宿主細胞相應受體的識別。上面已提及S蛋白以S1,S2片段分布于冠狀病毒表面,其中S1片段參與病毒-細胞間的識別和結(jié)合,而S2片段含有三個α螺旋和一個融合活化區(qū),與病毒-細胞間的融合相關(guān)。S1片段與宿主細胞上相應受體結(jié)合可誘導S2片段構(gòu)象發(fā)生改變,暴露出S2片段內(nèi)的融合活化區(qū)而促進病毒與細胞膜的直接融合。有些冠狀病毒對宿主細胞的侵染力對溫度敏感,這可能主要由于S1-S2片段間的結(jié)合力與溫度有關(guān)。還有些冠狀病毒與宿主細胞膜的直接融合不需要S蛋白與其受體的識別,這種融合常對周圍pH敏感,這可能由于S1-S2間結(jié)合力的強弱與pH有關(guān),此種融合可能在侵染后期促進病毒在宿主細胞間的直接播散和進一步侵染。有些冠狀病毒能以多種方式進入宿主細胞。病毒以不同方式進入細胞是一個病毒與宿主細胞間相互作用的過程,依賴于兩者表面不同分子間的相互作用。2.2病毒基因組的銜接冠狀病毒進入宿主細胞后,利用宿主細胞內(nèi)的元件來復制其基因組、表達不同的蛋白質(zhì),并利用宿主或其自身的蛋白酶對病毒的基因和蛋白質(zhì)前體進行加工。冠狀病毒的基因組為單鏈正義RNA,結(jié)構(gòu)特點為多順反子(polycistron),5′和3′端含非翻譯區(qū),有6～12個開放閱讀框(ORF)。冠狀病毒的基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工很獨特。除基因組mRNA外,冠狀病毒基因轉(zhuǎn)錄的其余亞基因組mRNA間具有巢式(nested)結(jié)構(gòu)特征和一段共同的3′端序列。除最小的亞基因組mRNA外,編碼其余蛋白質(zhì)的mRNA均包含自身的基因和其3′下游編碼其他蛋白質(zhì)的基因,但因每個蛋白質(zhì)的基因都有終止密碼子的存在,僅5′端的首個ORF才能被翻譯。這些亞基因組mRNA的5′端均帶有一段來自冠狀病毒基因組5′最前端的保守引導序列(leadersequence),這段引導序列對病毒基因的表達有很強的順式作用。這些具有特殊結(jié)構(gòu)亞基因組mRNA的產(chǎn)生是由冠狀病毒的基因組所決定的,這也為分子病毒學家提供了一種新的RNA拼接機制。冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白分別由其基因組3′端的不同ORF編碼翻譯。有些結(jié)構(gòu)蛋白的成熟需要在高爾基體內(nèi)加工和宿主蛋白酶的剪切,病毒自身編碼的蛋白酶似乎不參與這一過程。病毒自身編碼的蛋白酶對其自身復制所必需的酶的加工成熟起重要作用。冠狀病毒復制所必需的酶有RNA聚合酶(polymerase)和解旋酶(helicase),由基因組5′端的占2/3～3/4的兩個大的ORF(ORF1a和1b)(即基因1)所編碼。藉核糖體閱讀框移行(ribosomalframeshift)機制,基因1可被翻譯產(chǎn)生ORF1a和ORF1ab兩個多肽前體(pp1a和pp1ab)(圖2)。迄今已知pp1a多肽前體主要由輔助蛋白酶區(qū)(PLP1,2),主要蛋白酶區(qū)(3CLpro),疏水區(qū)(HD)等組成,而pp1ab前體內(nèi)有如下結(jié)構(gòu)域:除了pp1a所編碼的蛋白外,還有RNA聚合酶,解旋酶和鋅指區(qū)等。PLP1,2蛋白酶主要參與RNA聚合酶上游蛋白質(zhì)的加工,而RNA聚合酶和解旋酶等由3CLpro蛋白酶加工成熟(圖2,3)。PLP酶切所產(chǎn)生的蛋白對病毒是必需的,能激活病毒mRNA的合成。3CLpro是冠狀病毒主要的蛋白質(zhì)加工酶,對病毒的復制增殖至關(guān)重要,這已為許多3CLpro突變體及其抑制劑等實驗所證實。SARS病毒的基因組分析表明,其復制酶(replicase)ORF1a和1b占整個基因組的2/3,長度和所編碼的氨基酸序列與其他冠狀病毒具有很高同源性(圖4)。3CLpro對SARS病毒的復制增殖至關(guān)重要,這將為SARS的防治提供一個很好的藥物靶點。冠狀病毒的結(jié)構(gòu)性膜蛋白均為糖蛋白,糖鏈可以O-或N-方式連接到膜蛋白上。對于M蛋白,第二類冠狀病毒的糖鏈是以O-方式連接,而第一、三類冠狀病毒則采用N-連接方式。雖然MHV的M蛋白O-糖基化對病毒樣顆粒的組裝和病毒的生長均沒有影響,但用N-糖基化取代后病毒樣顆粒的組裝效率明顯下降。考慮到冠狀病毒M蛋白上糖基化序列具有高度保守性,其糖基化修飾可能與病毒-宿主間相互作用有關(guān)。MHV-2是MHV家族具有高度侵染力的病毒株,與MHV-A59的區(qū)別在于其M蛋白不僅被O-糖基化,還被N-糖基化。對MHV-A59的S蛋白進行N-糖基化修飾能影響S蛋白的成熟和胞內(nèi)運輸及病毒顆粒的組裝和釋放。2.3病毒基因組rna的組裝冠狀病毒是一種有包膜的RNA病毒,其蛋白均在宿主細胞內(nèi)翻譯和加工。S和M蛋白是所有冠狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒體上還有少許的小分子E膜蛋白,另外有些冠狀病毒還有HE蛋白等,它們的相互作用是組裝成病毒顆粒的基礎。冠狀病毒顆粒的組裝發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體間的區(qū)域(intermediatecompartment)。N蛋白首先在胞漿中與病毒基因組RNA結(jié)合,形成螺旋形的核衣殼(nucleocaspsid)。核衣殼的N蛋白可進一步與病毒的E,S,M蛋白相互作用,進而組裝成病毒顆粒。但病毒樣顆粒的組裝卻不依賴于核衣殼,單純的M和E蛋白就足以形成病毒樣顆粒。由于E蛋白在病毒體上表達很少,M蛋白對病毒顆粒的組裝顯得更加重要。如前所述,M蛋白可分為:一個大的C端病毒體內(nèi)區(qū),三個穿膜片段和一個短的N端病毒體外區(qū)。病毒外殼組裝的驅(qū)動力主要來自于M蛋白穿膜區(qū)的側(cè)向相互作用,而且這種作用對同源M蛋白具有很高的選擇性。S蛋白通過其C端的跨膜區(qū)和病毒體內(nèi)區(qū)與M蛋白以非共價鍵連接而整合入病毒顆粒。E蛋白對病毒的復制增殖雖不是必需的,但缺乏了E蛋白,病毒組裝明顯受到影響且生長緩慢。冠狀病毒基因組RNA核心的組裝首先是通過N蛋白結(jié)合基因組RNA上的特殊包裝序列并形成核衣殼,進一步在病毒的出芽附近(即高爾基體前區(qū))藉N蛋白與M蛋白的相互作用選擇性組裝基因組RNA。冠狀病毒在宿主細胞內(nèi)能產(chǎn)生基因組RNA和6～8種亞基因組mRNA,雖然N蛋白可與病毒的所有mRNA結(jié)合,但只有結(jié)合基因組RNA的N蛋白才能與M蛋白發(fā)生相互作用,且這一過程不需要S、E蛋白的參與。進一步實驗表明,這種對病毒基因組RNA的高度選擇性包裝,是由病毒基因組RNA上的特殊包裝序列信號(packagesignal)所調(diào)控的。對MHV而言,這種包裝序列(約61bp)位于離5′端21kb附近。最近Narayanan等還進一步證實,在沒有N蛋白的情況下,僅M蛋白就能通過識別這一特殊的包裝信號來完成基因組RNA的組裝。初步組裝的冠狀病毒顆粒進一步通過高爾基體的加工形成胞內(nèi)體(endosome)樣的結(jié)構(gòu)(內(nèi)含成熟的病毒顆粒),再利用宿主細胞的分泌途徑以胞吐(exocytosis)方式釋放到細胞外,侵染新的宿主細胞。不同冠狀病毒的成熟病毒顆粒從宿主細胞的釋放有所不同,如TGEV,HCoV從細胞的腔側(cè)(apical)釋放,而MHV、FECV和FIPV等從基底側(cè)(basolateral)釋放。有的冠狀病毒可同時以這兩種方式釋放。在這個類極性分泌過程中S蛋白可能起著重要的引導作用。釋放的方式可能與病毒的播散和其所引起的感染和癥狀相關(guān),如TGEV主要局限于腸道感染,而MHV卻在宿主體內(nèi)廣泛播散。還有一些冠狀病毒以細胞融合的方式在宿主細胞間進行播散,當然有的也采用裂解宿主細胞來獲得釋放。上述冠狀病毒的生命周期可用簡單的模式圖5表示。3hcov-oc33感染的臨床表現(xiàn)冠狀病毒只侵染脊椎動物,在人和動物中的發(fā)病率很高。由于冠狀病毒的宿主細胞主要為上皮細胞,因而常引起人和動物的呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。冠狀病毒引起的人類疾病有兩類,首先是呼吸道感染,其次是腸道感染。冠狀病毒是成人普通感冒的主要病源之一,在兒童可以引起上呼吸道感染,一般很少波及下呼吸道。冠狀病毒感染的潛伏期一般為2至5天,平均為3天。典型的冠狀病毒感染呈流涕、不適等感冒癥狀。不同類型的病毒,其致病力不同,引起的臨床表現(xiàn)也不盡相同。HCoV-OC43病毒株引起的癥狀一般比229E病毒株嚴重。有報道冠狀病毒感染可以出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、嘔吐等癥狀。病程一般在1個星期左右,臨床過程輕微,沒有后遺癥。冠狀病毒可以引起嬰兒、新生兒急性腸胃炎,主要癥狀是水樣大便、發(fā)熱、嘔吐,嚴重者可以出現(xiàn)血水樣便。呼吸道冠狀病毒感染通過空氣飛沫傳播,感染高峰在秋冬和早春。不同病毒的流行有不同的周期性,一般間隔2至3年流行一次。冠狀病毒感染引起的免疫應答較差,再次感染較常見。有些冠狀病毒還能引起多發(fā)性硬化癥,如MHV在一些易感動物身上也能引起多發(fā)性硬化癥樣疾病,因而可被作為一種動物模型用于研究人類的多發(fā)性硬化癥。這次SARS病毒所引起的非典型肺炎的重癥急性呼吸綜合征與以往冠狀病毒所引起的人類疾病有所不同,表現(xiàn)為:患者通常有高于38℃的發(fā)熱,并會伴有寒顫或其他癥狀(如頭痛,倦怠和肌痛)。典型的病例通常不會有皮疹、神經(jīng)系統(tǒng)和腸胃系統(tǒng)癥狀。少數(shù)病例報道有腹瀉。3～7天以后,干咳無痰,呼吸困難,甚至出現(xiàn)低氧血癥,通常都需要氣管插管或依靠呼吸機。血象上,絕對白細胞計數(shù)減少,血小板減少。病程早期有肌酸磷酸激酶水平升高,肝轉(zhuǎn)氨酶水平升高。目前尚無特效治療方法,死亡率高。4反義核酸檢測冠狀病毒的毒副反應目前對于冠狀病毒的感染尚無特效的治療方法,預防顯得相當重要。冠狀病毒的侵染能引起機體產(chǎn)生免疫應答,如MHV、TGEV的侵染能誘導機體產(chǎn)生抗病毒侵染第一道防線的一個主要成員-IFNα。有些宿主細胞在受到冠狀病毒侵染后發(fā)生凋亡,從而限制病毒的復制增殖和減緩病毒在機體的播散。冠狀病毒的疫苗一直是世界各國許多科學家和公司努力研制的一個方向,并取得了一定的進展。從冠狀病毒的生命周期看,首先可以通過阻止病毒的入侵來預防。冠狀病毒的入侵和病毒與宿主細胞膜的融合是一個病毒-宿主細胞相互作用的過程,這需要病毒表面S蛋白與其宿主細胞上相應受體的結(jié)合。通過干擾它們間的相互作用,冠狀病毒的侵染就可能得到有效的控制。如針對MHV-A59的宿主細胞受體的單克隆抗體能有效地抑制MHV-A59對幼鼠的侵染,可溶性受體hAPN能阻止HCoV-229E病毒對宿主細胞的侵染。作為一些冠狀病毒(