自溶法制備甘露聚糖的工藝研究

自溶法制備甘露聚糖的工藝研究

祖母甘露醇糖位于母系膜的最外層。它與位于中間和外層的葡萄糖一起組成祖母膜的主要糖組成。由于其抗炎性、柔軟性、抗病性、革蘭氏菌病毒檢測(cè)等功能，已成為具有較高市場(chǎng)潛力的綠色飼料添加劑和食品添加劑。制備酵母多糖的一般方法有酸法和堿法，然而這些方法對(duì)環(huán)境污染較大，制約了酵母多糖的工業(yè)化生產(chǎn)。酵母自溶是在自身水解酶類作用下的細(xì)胞自身解體過程，其主要作用酶類為蛋白酶，自溶時(shí)生物膜首先被破壞，然后產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的水解，由于內(nèi)源葡聚糖酶、甘露聚糖酶作用的最適溫度較低，在一般自溶條件(50～60℃)下活性很低，細(xì)胞壁成分分解較差，因此，自溶最后常剩下細(xì)胞外殼。由于整個(gè)自溶過程條件溫和、無環(huán)境污染，因此酵母自溶法有望成為制備酵母多糖的一種有效方法。本實(shí)驗(yàn)擬研究自溶法制備啤酒廢酵母甘露聚糖的工藝條件，并將優(yōu)化后的自溶法和常用的酸堿法進(jìn)行比較，最后對(duì)最優(yōu)自溶條件在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。1材料和方法1.1材料和方法啤酒廢酵母青島啤酒股份有限公司。甘露單糖、葡萄糖為分析純，木瓜蛋白酶(20～300萬U/g)。1.2蒸發(fā)光散射器nmfUNICOUV-2000分光光度計(jì);島津液相色譜系統(tǒng)(CBM-20A、LC-20AD、SIL-29A、CTO-20AC、Sedex75蒸發(fā)光散射器檢測(cè)儀);Hanbon氨基柱;KJELTECTM2300FOSS全自動(dòng)定氮儀;恒溫水浴鍋;離心機(jī);具塞離心管;磁力攪拌器;FMG-5L發(fā)酵罐上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司。1.3方法1.3.1總甘草糖、總氮和總水楊酸的測(cè)定總甘露聚糖的測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行；上清液中甘露單糖、葡萄糖的測(cè)定參照HPLC法；總氮測(cè)定采用凱氏定氮法；總核苷酸測(cè)定采用紫外吸收法。1.3.2酵母泥的制備取新鮮啤酒廢酵母，用0～4℃蒸餾水洗滌并離心(6000r/min,10min)，重復(fù)2次至上清液無色，得到預(yù)處理的酵母泥。取處理后的酵母泥6×4.0g懸浮于6×4.0ml0.1mol/LpH7.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中自溶，自溶在具塞離心管中進(jìn)行，自溶溫度為50℃，恒溫水浴保溫，自溶時(shí)間24h，每隔4h取一次樣，離心(6000r/min,10min)，取沉淀測(cè)定總甘露聚糖含量。1.3.3微膠囊的聚糖合成根據(jù)1.3.2確定的自溶時(shí)間，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，進(jìn)行不同自溶條件實(shí)驗(yàn)，確定自溶優(yōu)化條件。酸法、堿法制備甘露聚糖參照文獻(xiàn)、進(jìn)行。酸法：配制1.0mol/L醋酸溶液100ml，加入預(yù)處理的酵母泥5g，在90℃下反應(yīng)3h,6000r/min離心10min，沉淀物水洗2次后用于測(cè)定甘露聚糖含量；堿法：配制1.0mol/L氫氧化鈉溶液100ml，加入預(yù)處理的酵母泥5g，在90℃下反應(yīng)3h,6000r/min離心10min，沉淀物水洗2次后用于測(cè)定甘露聚糖含量。1.3.4此外，酶對(duì)自溶效果的影響以1.3.3確定的自溶條件進(jìn)行不同添加時(shí)間、不同濃度蛋白酶自溶條件實(shí)驗(yàn)，確定外加蛋白酶對(duì)自溶效果的影響。1.3.5實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)展以1.3.3確定的自溶條件取預(yù)處理后的1500g新鮮啤酒廢酵母在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解酶活性的影響由圖1可知，在自溶的16h內(nèi)，酵母殘?jiān)懈事毒厶呛吭黾颖容^緩慢，這是因?yàn)榻湍讣?xì)胞死亡需要一定的時(shí)間，只有當(dāng)細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的各類水解酶才能被活化發(fā)揮作用，從而使酵母細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸從細(xì)胞內(nèi)溶出至上清液中。開始保溫自溶16h后胞內(nèi)酶開始發(fā)揮顯著作用，20～24h后甘露聚糖的濃度變化趨于穩(wěn)定。所以選擇24h作為自溶時(shí)間。2.2自溶法和常用的酸法、堿法制備露天氣溶劑提取效果比較一般來說，影響蛋白酶活力的主要因素有溫度、pH值、NaCl濃度，選取溫度、pH值和NaCl濃度三個(gè)因素的三個(gè)不同水平，利用L9(33)正交試驗(yàn)表(表1)，測(cè)定不同自溶條件下酵母殘?jiān)械母事毒厶呛?，以確定最優(yōu)的自溶條件，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。以酵母殘?jiān)械母事毒厶呛繛榕袛嘧匀苄Ч闹笜?biāo)，根據(jù)表2，酵母自溶的最優(yōu)條件組合為A2B2C2，即50℃、pH6、2%NaCl(W/V)，在此條件下，酵母殘?jiān)懈事毒厶呛繛?64.95mg/g。從表2極差的大小可以看出，因素的重要性次序?yàn)椋簻囟?gt;NaCl濃度>pH值。進(jìn)一步比較優(yōu)化條件后的自溶方法和常用的酸法、堿法制備甘露聚糖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表3可以看出，自溶法制備的酵母殘?jiān)懈事毒厶呛考s為酸法、堿法的2倍，對(duì)于作為雜質(zhì)的蛋白質(zhì)，自溶法含量為酸法、堿法的1/2，三種方法中核酸雜質(zhì)含量接近，約為750μg/g。酸法、堿法的酵母殘?jiān)懈事毒厶呛枯^低，可能是因?yàn)樗岱?、堿法反應(yīng)條件較自溶法劇烈，致使部分甘露聚糖轉(zhuǎn)移到上清液中，同時(shí)酵母細(xì)胞壁是由一個(gè)三層壁障致密結(jié)構(gòu)，其外層為甘露聚糖形成的糖蛋白、中層為堿溶性β-葡聚糖，內(nèi)層為堅(jiān)硬的堿不溶性β-葡聚搪，即使劇烈的酸法、堿法反應(yīng)條件也不足夠完全破壞酵母細(xì)胞壁，使胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸滲漏出胞外，而自溶法卻能利用自身的蛋白酶降解膜蛋白增加細(xì)胞壁通透性，并使胞內(nèi)蛋白質(zhì)在蛋白酶、核酸在核酸酶作用下降解為小分子肽、核苷酸，使蛋白質(zhì)、核酸更容易滲透到胞外。2.3可溶性甘薯淀粉中露天酸對(duì)甘薯聚糖含量的影響為了進(jìn)一步提高酵母自溶殘?jiān)械母事毒厶呛浚瑢?shí)驗(yàn)研究了外加蛋白酶對(duì)酵母自溶的影響。在2.2確定的最優(yōu)自溶條件下的自溶混合物中分別加入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的木瓜蛋白酶(20～300萬U/g)，50℃自溶24h，并以加蛋白酶1%后自溶作為對(duì)照，離心取殘?jiān)恋頊y(cè)定其中甘露聚糖的含量，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，外加蛋白酶對(duì)提高酵母殘?jiān)懈事毒厶呛坑幸欢ㄗ饔?，?.4%的加入量以內(nèi)，酵母殘?jiān)懈事毒厶呛吭黾颖容^顯著，0.4%～1.2%的蛋白酶加量范圍內(nèi)，酵母殘?jiān)懈事毒厶呛孔兓呌诜€(wěn)定，所以，如果添加蛋白酶，可以選擇0.4%作為最適加酶量，但考慮到即使在0.4%蛋白酶加入量時(shí)，酵母殘?jiān)懈事毒厶呛績H增加13.85%，且蛋白酶成本較高，所以，不適合通過外加蛋白酶的方式提高酵母殘?jiān)懈事毒厶呛浚虼?，本?shí)驗(yàn)選擇不加蛋白酶的方式進(jìn)行酵母自溶放大實(shí)驗(yàn)。2.4自溶法制備培育甜聚糖以2.2確定的最佳自溶條件在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。根據(jù)表4，放大實(shí)驗(yàn)酵母殘?jiān)械母事毒厶呛繛?49.00mg/g，與2.2小試中164.95mg/g接近，因此酵母自溶最優(yōu)條件得到較為成功的375倍放大。對(duì)表4的結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在此條件下，沉淀、上清液中甘露聚糖分別占原料中甘露聚糖的92.05%、0.72%，即酵母自溶法中甘露聚糖的得率為92.05%，沉淀、上清液中甘露聚糖量之和小于原料中的甘露聚糖總量，是因?yàn)樵诎l(fā)酵罐自溶操作中有一定的物料損失。進(jìn)一步對(duì)上清液進(jìn)行HPLC分析得到圖3的HPLC圖譜。以增高法分析發(fā)現(xiàn)，1號(hào)峰為甘露單糖，含量為55.72μg/ml,2～7號(hào)峰均不是葡萄糖，對(duì)比表4中上清液甘露聚糖含量發(fā)現(xiàn)，上清液中總的甘露聚糖含量遠(yuǎn)大于甘露單糖含量，據(jù)此可以初步認(rèn)為，轉(zhuǎn)移至上清液中的甘露聚糖主要是含兩個(gè)單糖分子以上的寡糖，而不是甘露單糖。3最佳自溶條件的確定本實(shí)驗(yàn)研究了自溶法制備啤酒甘露聚糖的工藝條件，并將優(yōu)化后的自溶法和常用的酸堿法進(jìn)行了比較，最后對(duì)最優(yōu)自溶條件在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行了放大實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，自溶24h后，酵母殘?jiān)械母事毒厶呛窟_(dá)到最高值；制備啤酒廢酵母細(xì)胞壁的最佳自溶條件為：溫度50℃，NaCl2%，pH6，在此條件下，酵母自溶殘?jiān)懈事毒厶呛窟_(dá)到164.95mg/g，而傳統(tǒng)的酸法、堿法所得酵母殘?jiān)懈事毒厶堑暮繛?3.35、87.60mg/g，自溶因素的重要性次序?yàn)椋簻囟?gt;NaCl濃度>pH值；外加蛋白酶有利于提高自溶殘?jiān)懈事毒厶堑暮?，外?