凝膠電泳分離蛋白質的研究

凝膠電泳分離蛋白質的研究

對蛋白質組的研究表明，細胞的生長和分化的動態(tài)變化通過比較不同環(huán)境下細胞或組織的不同差異來觀察。在正常和疾病條件下，基因啟動的數(shù)量和結構的變化有助于早期發(fā)現(xiàn)疾病，了解疾病的發(fā)病機制，并制定適當?shù)闹委煷胧?。目前蛋白質組研究的主要技術手段是二維凝膠電泳、計算機圖像分析和蛋白鑒定技術。蛋白鑒定方法有氨基酸序列分析、組成分析、肽質量指紋譜和肽序列標簽分析等。其中肽質量指紋譜(peptidemassfingerprinting,PMF)方法鑒定蛋白質是目前蛋白質組研究較為常用的鑒定方法。由于各種蛋白質的氨基酸序列(一級結構)不同,蛋白質被酶解后產(chǎn)生的肽段序列也各異,肽混合物質量數(shù)亦具特征性,稱為肽質量指紋譜(PMF),可用于蛋白質的鑒定?；|輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)是最有效的分析肽混合物的質譜儀,肽混合物不需分離可直接分析,基質輔助激光電離方法能耐受一定濃度的鹽,儀器靈敏度高,標準樣品1pmol的量就足夠,質量數(shù)準確度可達0.1‰～0.01‰,且操作簡單,分析速度快,依儀器型號不同一次可分析十幾個到幾十個樣品。二維凝膠電泳分離的細胞或組織蛋白,經(jīng)膠上原位酶切和質譜分析得到肽質量指紋譜,用數(shù)據(jù)庫檢索軟件將實驗所得肽質量數(shù)與數(shù)據(jù)庫中每種蛋白質的酶解理論肽質量數(shù)相比較來鑒定蛋白質。我們曾用標準蛋白質對這一方法進行過初步的探索。用PMF鑒定蛋白質消耗少,效率高,肽譜制備階段可同時處理多個樣品,適合大規(guī)模,高通量的蛋白質鑒定工作。研究腫瘤細胞蛋白質組,有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn),研究腫瘤的致病機制,開發(fā)新的治療措施及藥物。本文報道用標準蛋白質建立了肽質量指紋譜鑒定技術,并應用于鑒定二維凝膠電泳分離的人肺巨細胞癌細胞蛋白質。1材料和方法杏仁1.1表面活性劑和儀器人肺巨細胞癌PLA-801細胞株由軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所陸應麟教授惠贈。30%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺(29∶1,3.3%C)溶液、三羥甲基氨基甲烷購自Bio-Rad公司;IPG膠條購自AmershamPharmacia公司;三氟乙酸(TFA)購自Fluka公司,乙腈(ACN)購自Fisher公司;胰蛋白酶(trypsin,modified、sequencinggrade)購自Boehringer公司;α-氰基-4-羥基肉桂酸、胰島素、胰島素氧化B鏈購自Sigma公司。固相pH梯度等電聚焦儀IPGphorIEFSystem為AmershamPharmacia公司產(chǎn)品;垂直板電泳儀PROTENIIxiCell及附件、PDQUEST6.0二維電泳圖像分析軟件為Bio-Rad公司產(chǎn)品。TofSpecMALDI-TOF-MS為Micromass公司產(chǎn)品;BIFLEXIIIMALDI-TOF-MS為Bruker公司產(chǎn)品,具反射(reflector)和延遲提取(delayedextraction)功能。1.2方法1.2.1ipg-sds-東南角電泳人肺癌細胞株PLA-801細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清培養(yǎng)基,收集細胞加裂解液快速凍融3～4循環(huán),離心收集上清。用IPGphorIEFSystem進行第一向等電聚焦電泳,蛋白質上樣量250μg。等電聚焦程序:12h重泡漲,其間加低電壓(<50V)幫助樣品進入IPG膠條;200V,1h;500V,1h;500～1000V線性上升1h;8000V,8h。聚焦完畢的IPG膠條在平衡液中平衡30min,轉移到SDS均勻膠上(12.5%T,3.3%C,20cm×20cm×0.1cm),待封膠液凝固后用PROTENIIxiCell進行第二向電泳,恒流48mA,直至溴酚藍前沿到達玻璃板底部?？捡R斯亮藍G-250染色2h,脫色過夜。1.2.2tfa質譜條件的測定選取2D膠上3個蛋白斑點(圖1),編號為2D-1、2D-2、2D-3,用刀片沿斑點染色邊緣切下蛋白點置于樣品管中。用含50%乙腈,25mmol/L碳酸氫銨溶液脫色,膠片真空離心干燥。胰蛋白酶用25mmol/L碳酸氫銨溶液配成0.01g/L溶液,加8～10μL于各樣品管中,37℃保溫20h。加入5%TFA溶液120μL于40℃保溫1h,吸出上清,加入2.5%TFA,50%ACN溶液120μL于30℃保溫1h,合并上清液冰凍干燥。加5μL0.5%TFA液溶解,混勻后質譜分析?；|:α-氰基-4-羥基肉桂酸,內(nèi)標:胰島素(Micromass公司TofSpec型MALDI-TOF-MS),外標:胰島素氧化B鏈(Bruker公司BIFLEXIII型MALDI-TOF-MS)。1.2.3蛋白質序列數(shù)據(jù)庫的搜索2結果和討論顯著2.1paldi-tof-ms及glu-c蛋白酶特點用標準蛋白質建立了膠上蛋白質原位酶切的方法。膠上蛋白質與酶處于不同的介質中,酶與蛋白質充分接觸并發(fā)揮作用是酶解成功的關鍵。膠中的染料(考馬斯亮藍)和其他組分(如Tris、甘氨酸、SDS等)對以后質譜分析的影響也不容忽視。用考馬斯亮藍染色的蛋白質條帶制備肽譜時,即使上膠蛋白質量達50μg,質譜分析也無結果,說明染料嚴重影響質譜分析靈敏度?？捡R斯亮藍(coomassiebrilliantblue,CBB)是一種陰離子染料,與蛋白質的堿性基團結合,形成染料-蛋白質復合物。為了除去染料,經(jīng)比較選用含50%ACN,25mmol/L碳酸氫銨的溶液清洗膠片,ACN可洗去藍色染料,碳酸氫銨可保持膠的堿性環(huán)境,利于以后的酶解反應。蛋白質條帶酶切前先切成細小碎片,并干燥脫水。切小的目的是增大膠與酶液的接觸面積;干燥脫水是為了讓膠在酶液中重泡漲,充分吸收酶液。未脫水的膠酶解液不能滲入,蛋白質與酶無法接觸,實驗均無結果。用于制備肽譜的酶需具以下特點:酶的水解位點專一;酶切產(chǎn)生的蛋白質肽段大小適合質譜分析并利于數(shù)據(jù)庫檢索;酶自身穩(wěn)定,不易自降解。有文獻報道,用PMF檢索數(shù)據(jù)庫時,若要提高檢索準確度則產(chǎn)生肽譜的酶切點至少要有2個,而分子量大于5000的肽片段對檢索沒有很大幫助。胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶較多用于肽譜制備,胰蛋白酶水解位點在賴氨酸(K)和精氨酸(R)的羧基端,產(chǎn)生以K和R為C末端的肽段。一般蛋白質經(jīng)胰蛋白酶水解后多產(chǎn)生平均質量數(shù)1000～3000的肽段。MALDI-TOF-MS適宜測量質量數(shù)在500以上的分子(在幾kD以內(nèi)質量準確度較高),所以胰蛋白酶酶切產(chǎn)生的片段適于質譜分析。Glu-C也適用于肽譜制備,但其價格較昂貴,本實驗室較少使用。我們使用Boehringer公司提供的修飾過的測序級胰蛋白酶,此酶分子中連接了多聚物,減少了酶的自降解。2.2tkis-大力發(fā)現(xiàn)并進行了分子質量鑒定的過程數(shù)據(jù)庫檢索程序根據(jù)輸入的蛋白質等電點、分子量范圍及肽指紋譜數(shù)據(jù)和其他一些參數(shù)在數(shù)據(jù)庫中尋找與這些參數(shù)相匹配的蛋白質。人肺巨細胞癌細胞株的細胞蛋白質雙向電泳分離譜圖如圖1所示,取膠上3個蛋白質斑點制備肽質量指紋譜(圖2～圖4),數(shù)據(jù)庫檢索參數(shù)如表1所示。點2D-1的檢索結果如表2所示,在設定的參數(shù)范圍內(nèi),MS-Fit檢索到一種蛋白質,鑒定斑點2D-1可能為甘油醛-3磷酸脫氫酶2(glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase,G3P2),肽段的序列覆蓋率為51%。點2D-2的檢索結果如表3所示,在設定的參數(shù)范圍內(nèi),PeptIdent檢索到一種蛋白質,鑒定斑點2D-2可能為遍在蛋白羧基末端水解同工酶(ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozyme,UBL1),肽段的序列覆蓋率為54.3%。點2D-3檢索結果如表4所示,在設定的參數(shù)范圍內(nèi),PeptIdent檢索到7種蛋白質,前6種均為磷酸丙糖異構酶(triosephosphateisomerase,TPIS),差別在于蛋白質的種屬不同。從結果列表中可看出不同物種的此蛋白質序列同源性,得分值由高到低分別為人、獼猴、兔、大鼠、小鼠、雞的TPIS,表現(xiàn)出了進化樹的趨勢。TPIS-HUMAN的肽譜與實驗測定結果最吻合,得分最高,且已知實驗所用細胞為人肺細胞,故可鑒定蛋白斑點2D-3為人丙糖磷酸異構酶,序列覆蓋率66.9%。蛋白2D-3的肽譜實驗值與TPIS-HUMAN理論值的比較見表5:在二維電泳數(shù)據(jù)庫SWISS-2DPAGE中檢索蛋白質TPIS-HUMAN,發(fā)現(xiàn)在已登錄的15種人細胞/組織的蛋白質二維電泳圖譜中,有8種細胞/組織的蛋白質電泳圖譜中鑒定出了此蛋白質,鑒定方式大部分為圖譜比較和測序、氨基酸分析。1999年1月登錄的結腸腺癌細胞二維電泳譜中的TPIS-HUMAN蛋白斑點的鑒定使用了PMF方法,肽片段序列覆蓋率為63.3%,與我們的結果相近。從2D圖中看出,點2D-2與2D-3的表觀分子量與其理論分子量不符,這可能是由于蛋白質不規(guī)則的電泳行為造成。許多蛋白質在SDS電泳中表現(xiàn)出的分子量與實際分子量都有偏差,某些無翻譯后修飾的小蛋白質的分子量誤差可達30%。用PMF法鑒定蛋白質的成功離不開質譜技術的發(fā)展,儀器所測肽質量數(shù)越精確,檢索結果越可靠。新一代的MALDI-TOF-MS分析肽混合物可達fmol的靈敏度和萬分之一的質量精確度。這從技術上推進了蛋白質組的研究,使PMF方法鑒定蛋白質成為蛋白質組研究中大規(guī)模鑒定的首選方法。在SWISS-2DPAGE庫中,以往登錄的蛋白質鑒定手段大部分是譜圖比較、免疫印跡、測序和氨基酸組成分析,很少用到質譜技術。而1999年1月登錄的人結腸腺癌細胞二維電泳譜圖中,10