【熒光酶免疫在臨床中的應用研究4100字】

熒光酶免疫在臨床中的應用研究綜述報告目錄TOC\o"1-2"\h\u28376熒光酶免疫在臨床中的應用研究綜述報告 1130741熒光酶免疫分析 1236232熒光酶免疫的臨床應用 351652.1材料 3210822.2FEIA檢測方法 394432.3結(jié)果 325682.4討論 4308593酶免疫分析的局限及發(fā)展趨勢 530365參考文獻： 6摘要：酶免疫分析是標記免疫分析中的一項重要技術(shù)，是以酶標記的抗體作為主要試劑，將抗原抗體反應的特異性和酶催化底物反應的高效性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)作為經(jīng)典的三大標記技術(shù)之一。酶免疫技術(shù)在臨床醫(yī)學中得到廣泛應用并不斷得到更新，不斷和其他先進技術(shù)如熒光、發(fā)光技術(shù)以及儀器自動化相融合，在臨床中的的應用也越來越頻繁?；诖吮疚灰詿晒饷该庖咴谂R床中的應用為主題進行了探討，對熒光酶免疫主題的內(nèi)容進行了進一步的深入思考。關(guān)鍵詞：熒光酶；臨床；免疫1熒光酶免疫分析熒光酶免疫分析即在普通的酶免疫分析的基礎上，用理想的酶熒光底物代替顯色底物，可提高檢測的靈敏度，擴大檢測范圍，減少各種試劑和樣品。這一劑量已成為酶免疫測定的微敏感方法。熒光底物的理想條件是:(1)穩(wěn)定性:貯存期穩(wěn)定，在適當條件下貯存時間長，不超過酶解熒光產(chǎn)物。這種酶起作用快一些。(3)產(chǎn)品穩(wěn)定，具有較強的熒光性。(4)寬的Stokes位移，并傾向選用激發(fā)光波長較長者，因低能量的激發(fā)產(chǎn)生較低的熒光本底。目前對酶免疫分析常用的三種酶POase、APase及BGase都有相應的熒光底物。下表中列出文獻報道的用不同底物酶免疫分析的靈敏度限值。由該表可見應用三種酶的熒光酶免疫分析的靈敏度都明顯高于普通的酶免疫分析。表1表應用不同底物酶免疫分析的靈敏度限值底物檢測體系檢測限值APase4-硝基酚磷酸酯(NPP)光度測定10000amol4-NPP光度測定50amol4-MUP熒光測定0.5amol4-MUP熒光測定lamol/lOOminPOase(HRPOase)鄰苯二胺(OPD)光度測定25amol/min4-羥基苯乙酸熒光測定2amol/min3-(4-羥基苯)丙酸熒光測定0.03amol/min熒光素(luciferin)發(fā)光測定0.125amolBGase2-硝基酚-P-D半乳糖甘光度測定lOOamol/min(ONPG)4-MUG熒光測定0.003amol/min注:amol,即atomol,為l0-18mo］早期熒光素酶免疫測定沒有專門的輔助儀器。反應后，樣品需要移動到一個測量杯，用熒光計測量。目前熒光免疫分析儀器中通用的測量儀器較少，分析方法與儀器之間存在很強的依賴性。大多數(shù)放射免疫分析和普通酶免疫分析是通用的，儀器制造商通常不生產(chǎn)相應的檢測試劑盒。目前，隨著96孔板中酶免疫分析方法的應用越來越廣泛，出現(xiàn)了多種通用酶免疫分析閱讀器(reader)，針對各種酶的常見底物的波長濾光片也不斷出現(xiàn)。熒光素酶免疫分析法是在常規(guī)酶免疫分析法的基礎上發(fā)展起來的。隨著96孔板的廣泛應用，有必要建立一種通用的96孔板熒光素酶免疫分析方法。實際上，已有該類儀器生產(chǎn)，如TecnosumaInternational生產(chǎn)的雙用的PR-52196孔板測量儀(dualplatereader,pho-tometerandfluorometer),就備有兩套光源，既可用于酶免疫分析又可用于熒光酶免疫分析。后者使用的96孔板是一種白色不透明塑料板，有助于反射和收集發(fā)射的光。為了減少熒光背景，黑色不透明塑料板也可以用來反射和收集發(fā)射的光。黑色不透明塑料片也可以用來減少熒光背景。綜上所述，熒光素酶免疫分析是一種靈敏度高、測量范圍寬的分析技術(shù)，但應特別注意避免熒光分析中最常見的問題，即熒光背景增強。因此，除設計熒光測量儀本身外，還應特別注意分析:各種試劑的純度和清潔度，熒光底物的純度和保存度，熒光底物加入后的適當孵育時間的確定，以及避免外部來源。熒光材料的污染和清洗的徹底性。2熒光酶免疫的臨床應用2.1材料（1）正常血標本∶取自北京地區(qū)出生后72h的正常新生兒足跟血，吸于特制的濾紙上，呈直徑10mm血斑，自然干燥后備用，共1794份。（2）質(zhì)控品∶美國疾病控制中心（CDC）提供的篩查用TSH濾紙干血片質(zhì)控品。（3）試劑及設備;芬蘭Labsystems公司提供FEIA法篩查用TSH試劑及熒光讀數(shù)儀等設備。ELISA及IRMA法試劑分別由美國GBI及DPC公司提供。2.2FEIA檢測方法用直徑3mm打孔鉗，在濾紙干血片上（包括標準品、質(zhì)控品、及被測樣品）打2個血片，分別置包被板孔中，加入酶標記抗體（1∶100稀釋），900次/min振蕩2h后，棄掉孔中紙片及液體，用1∶10沖洗液沖洗4次，再加入200ml熒光底物;室溫振蕩lh后，加入100ml終止液，在320nm/405nm波長下進行熒光比色，以機載軟件處理TSH含量檢測結(jié)果。2.3結(jié)果2.3.1精確性;（1）批內(nèi)變異系數(shù)（CV）∶以該試劑盒提供的B、D、F3個TSH標準品作為TSH低、中、高含量的被測物，批內(nèi)重復測定16次，其均值十標準差和批內(nèi)變異系數(shù)如下∶標準品B為491＋35，CV0.072;標準品D為1889＋180，CV0.095;標準品F為3735＋273，CV0.073。批內(nèi)平均CV為0.080。（2）批間CV∶取本試劑盒提供的TSH低值和高值質(zhì)控品，于不同試驗批次內(nèi)測定8次，統(tǒng)計CV值，低、高質(zhì)控CV值為0.120和0.092，平均CV為0.110。2.3.2準確性∶取CDC提供的高、中、低3個TSH含量質(zhì)控品，每濃度重復3次，其重現(xiàn)率見表1。表23種方法檢測TSH質(zhì)控品的重現(xiàn)率樣品TSH含量次數(shù)理論值測定值（mIU/L）重現(xiàn)率（%）FEIAELISAIRMAFEIAELISAIRMA低32525.423.929.9101.695.9119.6中34038.641.242.796.5102.9106.7高38072.980.783.591.1100.9104.42.3.3靈敏度：以該試劑盒的A、B2個TSH標準品分別檢測3次，按傳統(tǒng)靈敏度檢測方法，依吸光度值（A）的x±3s統(tǒng)計最低檢測限為4.14mIU/L。2.3.4FEIA、ELISA、IRMA方法的相關(guān)性∶用3種方法檢測同一組72份新生兒血標本TSH含量，試驗結(jié)果做統(tǒng)計學相關(guān)性處理，F(xiàn)EIA方法與EISA和IRMA方法相關(guān)系數(shù)r分別為0.9698和0.9756（P<0.001)。2.3.5新生兒篩查中TSH切值的選擇∶對1794份新生兒血標本中的TSH使用FEIA法進行檢測，其頻數(shù)分布情況見表2。表31794例新生兒TSH含量頻數(shù)分布狀況分組(mIU/L)頻數(shù)(n)人群百分率（%）分組(mIU/L)頻數(shù)(n)人群百分率（%）0?26814.9412?30.171?35619.8413?10.062?41523.1314?30.173?27615.3815?00.004?18010.0316?00.005?1065.9117?00.006?754.1818?00.007?502.8719?00.008?241.3420?10.069?191.0621?00.0010?60.3322?00.0011?100.5623?2410.06經(jīng)統(tǒng)計正常新生兒人群TSH含量呈偏態(tài)分布。中位數(shù)為2.67mIU/L，高值端99%可信限為11.05mU/L，建議此方法甲低篩查切值（cutoff值）定為12mIU/L。超出者為可疑甲低患兒，需追蹤復查。2.4討論新生兒篩查是提高人口素質(zhì)的重大舉措之一，我國已開展了甲低及苯丙酮尿癥(PU)的篩查。篩選方法包括免疫放射測定法、酶聯(lián)免疫測定法、時間分辨熒光免疫測定法和熒光素酶免疫測定法。20世紀90年代初，Tuminen等報道了用3-o-羥基苯基二乙基酮酸作為底物，通過氧化酶的作用產(chǎn)生高靈敏度的熒光，然后在酶標記的基礎上替換原來的熒光底物。顯色底物作為熒光強度測定的定量基礎。作者認為，這種新型襯底具有較高的靈敏度，為FEIA法的快速發(fā)展奠定了基礎。作者報告使用該方法篩查新生兒甲狀腺功能減退癥在同一年。該方法與苯丙酮尿癥化學篩查中的熒光強度測定相同，可用于甲狀腺功能減退癥和苯丙酮尿癥的篩查。北京市新生兒TSH水平的99%置信限為11.05mlU/l。甲狀腺功能減退患兒TSH升高。建議甲狀腺功能減退篩查的臨界值為12mlu/l。我們實驗室過去用美國產(chǎn)品對同一區(qū)域的人進行甲狀腺功能減退篩查，閾值一般設定在20mlu/l左右，因為兩種標準產(chǎn)品的含量表達不同。實驗室系統(tǒng)產(chǎn)品的標準產(chǎn)品使用全血值進行校準。結(jié)果表明，該指標低于用血清值校準的美國產(chǎn)品的測定值。此外，我們發(fā)現(xiàn)，即使采用相同的技術(shù)，不同地區(qū)新生兒正常TSH水平也存在差異。如果報道，使用FEIA方法，正常新生兒TSH水平的99.9%的置信限為8.4mIU/L，導致較低的結(jié)果。此外，種群中TSH水平分布曲線的峰值低于本組，這可能與種群的區(qū)域差異有關(guān)。為此，建議根據(jù)所選儀器和試劑確定該領域的篩選閾值，以確保篩選開始前的篩選質(zhì)量。3酶免疫分析的局限及發(fā)展趨勢(1)酶免疫分析檢測的特異性實際上是由單克隆抗體所指向的抗原簇決定的，因此受試劑所使用的抗原和抗體的純度、特異性、穩(wěn)定性、特異性和純度的影響。當然，其他標記免疫方法也有問題，但要注意EIA試劑盒供應商的數(shù)量。(2)在酶免疫分析測定結(jié)果中目前所測的胰島素或C肽，近年發(fā)現(xiàn)是該物質(zhì)及其前體的混合物就是受抗體局限的明顯例子，是山于有交叉的抗原性而難以分開，因此通帶檢測的只能稱為“免狡反應性膿的素或Ｃ肽，這使行我們需亞新評價過去對所測的膿的素或Ｃ肽的認識，非致力于“真”或“純膿的蔡Ｃ的測定，類似的情況可能還會發(fā)現(xiàn)。（3）酶免疫分析以固相反應為主，在實驗中，該聚合物能夠填充四相包被抗原的不同部位(抗體不一致引起的農(nóng)業(yè)表面效應，聚合溫度和時間避免了側(cè)孔和中心孔反應帶的不一致)。一步法比兩步法更容易產(chǎn)生鉤效應?？乖c抗體比值不匹配引起的邊緣效應和鉤效應應引起重視。（4）固相材料存在非特異性吸附，標本諧血或冰箱貯存可釋放過氧化物酶，冰存時間過長可導致血消聚合甚到嚴重干擾測定。當然，隨著技術(shù)的進步和儀器自動化程度的提高，這些缺陷在自動化程度相對較低的儀器和工作量較大的實驗室中并不明顯，而在半自動儀器和少量樣品中則需要放在冰箱中保存，這些不足仍然是明顯的?？傊?，隨著科學發(fā)展和技術(shù)創(chuàng)新，酶免疫分析技術(shù)必將越來越完善，自動化程度越來越高，準確度和精密度越來越好，定將為人類的健康事業(yè)作出更大的貢獻參考文獻：[1]ShelverWL,KimHJ,LiQX.Developmentofamonoclonalanti-body-basedenzyme-inkedimmuosorbentassayforthebeta-4-drenergicagonistilpaterol[J].JAgricFoodChem,2005,53(9):3273-3280[2]WuFB,HeYF,HanSQ.Matrixinterferenceinserumtotalthy-rox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