虎耳草乙醇提取物抑菌活性的研究

虎耳草乙醇提取物抑菌活性的研究

虎耳草是虎耳草科的一種多年生多年生草本植物。它是一種天然的野生虎耳草，通常生長在潮濕的山坡上，在黃黃大地區(qū)。其主要成分有巖白菜素(bergenin)、槲皮素-3-鼠李糖苷(ouarcitrin)、槲皮素、原兒茶酸、沒食子酸、琥珀酸、反甲基丁烯二酸等。虎耳草藥用可治急性中耳炎、風(fēng)熱咳嗽等,農(nóng)業(yè)上有用于抑制葡萄霜霉病菌的報(bào)道。但目前有關(guān)虎耳草藥理方面的研究還很少。本文開展了虎耳草抑制細(xì)菌、酵母和霉菌生長的實(shí)驗(yàn)研究,對進(jìn)一步了解虎耳草的抑菌機(jī)理和綜合開發(fā)利用該植物具有重要理論和實(shí)踐意義。1菌種和培養(yǎng)基主要儀器和設(shè)備:恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、循環(huán)水真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、電熱高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、電熱干燥箱等。主要藥品:95%乙醇、瓊脂、氯仿、蔗糖、KCl、K2HPO4、FeSO4、MgSO4·H2O、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨等。武漢大學(xué)生命科學(xué)院提供的菌種為:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。細(xì)菌培養(yǎng)基(1000ml):牛肉膏3g、蛋白胨5g、瓊脂15—20g,加水至1000ml,調(diào)pH為7.2—7.4。酵母及霉菌培養(yǎng)基(1000ml):蔗糖30g、瓊脂15—20g、KCl0.5g、K2HPO41g、FeSO40.01g、NaNO33g,加水至1000ml,調(diào)pH為6.7。2實(shí)驗(yàn)方法2.1虎耳草醇提物的制備虎耳草由作者采自湖北省黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院的植物園。我們將鮮采的植物全株洗凈、晾干、剪碎,先稱取20.00g,置于75℃恒溫烘箱中烘11h左右,使其達(dá)到恒重,再次稱重得6.67g。由此可知,實(shí)驗(yàn)所用的虎耳草材料的含水量為66.65%。另取5kg虎耳草(折算后的干重為1667.5g)置入95%酒精中浸泡30d,期間經(jīng)常攪拌;然后用棉花阻隔過濾,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮,得膏狀物2312g。通過烘干和稱重得知被乙醇浸泡提取后的虎耳草殘?jiān)芍貫?371g,可見虎耳草原材料中有296.5g成分被提取進(jìn)入膏狀物中,膏狀物的含水量約為87.2%(1g膏狀物相當(dāng)于0.72g干燥虎耳草),膏狀提取物冷藏備用。2.2不同濃度的培養(yǎng)基平板時(shí)培養(yǎng)的微生物稱取膏狀提取物后用適量無菌水溶解,再用移液管定量吸取溶解液并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中。根據(jù)每培養(yǎng)皿中膏狀物含量的多少分別設(shè)置7個(gè)濃度梯度,即每皿分別為0.1g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g和空白組。接著將已加熱熔化的培養(yǎng)基按每皿12ml分別添加到培養(yǎng)皿中并與膏狀物均勻混合,然后放在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃濕熱滅菌15min,最后制成含一定濃度提取物的培養(yǎng)基平板,每一濃度的培養(yǎng)基平板重復(fù)3皿冷藏備用;將已活化的細(xì)菌種液、酵母菌種液和霉菌種液先用無菌水作適當(dāng)稀釋,接種到上述各培養(yǎng)皿中,用涂布耙將菌液涂布均勻,然后放到培養(yǎng)箱(細(xì)菌37℃、酵母和霉菌28℃)中培養(yǎng)。由于細(xì)菌生長較快,所以必須每天定時(shí)觀察。由于青霉和酵母生長較慢,所以可在培養(yǎng)3d之后再開始每天定時(shí)觀察。每次觀察時(shí)都要用測微尺測量菌落直徑大小,并用計(jì)數(shù)器記錄視野內(nèi)的菌落數(shù)目。實(shí)驗(yàn)過程中,如果發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的微生物除空白組能生長外,其它濃度組都不能生長,說明微生物生長已被完全抑制,這時(shí)必須降低提取物濃度,然后重復(fù)實(shí)驗(yàn)過程。如果發(fā)現(xiàn)所有濃度組中的微生物都能生長,且菌落大小、數(shù)目等都相近或相似,說明微生物生長未受影響,這時(shí)則應(yīng)提高提取物濃度,重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作過程,繼續(xù)觀察抑制作用是否發(fā)生。如此反復(fù)幾輪,最終就可找到能夠抑制微生物生長的最小濃度(MIC)。3結(jié)果與討論3.1不同濃度的膏狀乙醇提取物對枯草芽孢桿菌生長的抑制作用我們利用膏狀提取物每皿含量分別為0.1g、0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g和空白對照培養(yǎng)基培養(yǎng)6種待試微生物,細(xì)菌培養(yǎng)4d、產(chǎn)黃青霉和啤酒酵母培養(yǎng)6d后的觀測結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。表1說明,當(dāng)每一培養(yǎng)皿(含12ml培養(yǎng)基)中膏狀乙醇提取物的含量提高到1.0g時(shí),金黃色葡萄球菌的生長就會受到完全抑制;當(dāng)每一培養(yǎng)皿中膏狀乙醇提取物的含量提高到1.5g時(shí),蘇云金芽孢桿菌的生長就會受到完全抑制;當(dāng)每一培養(yǎng)皿中膏狀乙醇提取物的含量提高到2.5g時(shí),大腸桿菌的生長會受到完全抑制;當(dāng)每一培養(yǎng)皿中膏狀乙醇提取物的含量提高到2.0g時(shí),枯草芽孢桿菌的生長會受到完全抑制。可見,虎耳草乙醇提取物對4種細(xì)菌的生長都有明顯的抑制作用。此外,當(dāng)培養(yǎng)皿中膏狀乙醇提取物的含量逐漸增加時(shí),每一培養(yǎng)皿中菌落個(gè)數(shù)一般都會減少,但菌落直徑則不然,其中金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的菌落直徑有逐步變大的趨勢,而大腸桿菌的菌落直徑則有逐步變小的趨勢,這一現(xiàn)象是否說明虎耳草的這種抑菌作用既可完全抑制又可部分抑制?針對這一問題,我們利用液體培養(yǎng)測定細(xì)菌生長曲線的方法進(jìn)一步研究了提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用情況。初步研究結(jié)果表明:虎耳草乙醇提取物中天然成分復(fù)雜,生物活性千差萬別,有些成分能抑制細(xì)菌生長,另一些成分似乎還可以促進(jìn)其生長;在提取物取活性成分的綜合作用下,細(xì)菌生長曲線的對數(shù)生長期都有所提前;比較生長曲線穩(wěn)定期細(xì)菌生物量的變化后發(fā)現(xiàn),提取物的抑菌作用往往只在某一濃度時(shí)最強(qiáng),高于或低于這一濃度時(shí)變?nèi)?有時(shí)甚至表現(xiàn)為促進(jìn)作用。如用含膏狀提取物0.01g·ml-1、0.05g·ml-1和0.10g·ml-1的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)葡萄球菌時(shí),抑制作用會隨提取物濃度增加而增強(qiáng),當(dāng)提取物濃度高于0.10g·ml-1且分別等于0.15g·ml-1、0.20g·ml-1和0.25g·ml-1時(shí),原來的抑制作用變成了促進(jìn)作用,因?yàn)樵谶@3種提取物濃度下,細(xì)菌生物量都高于對照組。表1還表明,當(dāng)每一培養(yǎng)皿中膏狀乙醇提取物的含量由0.1g增至2.5g時(shí),產(chǎn)黃青霉除在菌落大小方面有些變化外,在菌落個(gè)數(shù)上未見明顯的變化趨勢;與此同時(shí),啤酒酵母的生長也未見抑制作用發(fā)生。3.2培養(yǎng)基的制備在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步精確配制每皿(12ml培養(yǎng)基)含膏狀提取物0.6g、0.7g、0.8g、0.9g的平板培養(yǎng)基并用以培養(yǎng)金黃色葡萄球菌;精確配制每皿含膏狀提取物1.1g、1.2g、1.3g、1.4g的平板培養(yǎng)基并用以培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌;精確配制每皿含膏狀提取物2.1g、2.2g、2.3g、2.4g的平板培養(yǎng)基并用以培養(yǎng)大腸桿菌;精確配制每皿含膏狀提取物2.6g、2.7g、2.8g、2.9g的平板培養(yǎng)基并用以培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:金黃色葡萄球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等4種細(xì)菌分別在每皿0.9g、1.1g、2.3g、1.7g等濃度的培養(yǎng)基上不能生長,而在對應(yīng)的較低濃度的培養(yǎng)基上可以生長。由此判定,虎耳草乙醇提取物(膏狀物)對這4種細(xì)菌的最小抑菌每皿濃度分別為0.9g、1.1g、2.3g和1.7g。我們對產(chǎn)黃青霉和啤酒酵母還使用每皿3.0g、4.0g、5.0g等含較高濃度膏狀提取物的培養(yǎng)基作抑菌實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,產(chǎn)黃青霉和啤酒酵母在所有濃度的膏狀提取物培養(yǎng)基上都能生長,即高濃度的虎耳草乙醇提取物對產(chǎn)黃青霉和啤酒酵母生長均無抑制作用。3.3虎耳草乙醇提取物對酵母生長無抑制作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果主虎耳草分布廣泛、生長迅速、生命力強(qiáng),在大別山地區(qū)野生資源非常豐富。虎耳草乙醇提取物對