rassf1a基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系

rassf1a基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的關(guān)系

近年來(lái)，通過(guò)遺傳因素的發(fā)展，提出了下降誘導(dǎo)半體生物基因的重要作用。在肺癌組織中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列抑癌基因存在啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化所導(dǎo)致的失活現(xiàn)象。其中部分抑癌基因的高甲基化與腫瘤發(fā)生、病情進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān),提示基因的甲基化可能是肺癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)的生物學(xué)標(biāo)志之一。自2000年Dammann等從人染色體3p21.3區(qū)域分離鑒定出RASSF1A并確定其為一新型抑癌基因至今,已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與肺癌患者預(yù)后相關(guān)。國(guó)內(nèi)亦有關(guān)于RASSF1A在腫瘤組織中表達(dá)異常的報(bào)道,但與肺癌預(yù)后相關(guān)性報(bào)道較少,因此我們就非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)中RASSF1A異常甲基化與患者生存預(yù)后進(jìn)行了臨床研究。1材料和方法1.1材料表面1.2提取的dna1.3亞硫酸氫鹽的制備1.4航式甲基化特定pcrms-pcr1.5結(jié)果記錄1.6產(chǎn)品試驗(yàn)序列1.7統(tǒng)計(jì)處理2結(jié)果2.1rassf1a啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)2.2rassf1a啟動(dòng)子甲基化率RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與年齡、性別、吸煙指數(shù)、腫瘤TNM分期均不相關(guān),但與開(kāi)始吸煙年齡、腫瘤分化程度相關(guān)。20歲前開(kāi)始吸煙的NSCLC患者RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率(56.7%)高于20歲后開(kāi)始吸煙的NSCLC患者(28.2%)(P=0.006);低分化NSCLC患者RASSF1A啟動(dòng)子甲基化率(51.6%)高于中分化(31.0%)和高分化(26.7%)NSCLC患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022,P=0.024),但中分化和高分化NSCLC之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。2.3手術(shù)時(shí)間與rassf1a啟動(dòng)子甲基化有關(guān)2.4rassf1a選擇子區(qū)高甲基化是nsclc后的獨(dú)立預(yù)后因素3rassf1a與nsclc預(yù)后的關(guān)系目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了在NSCLC、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中存在RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化?，F(xiàn)已明確抑癌基因RASSF1A在肺癌等腫瘤中表達(dá)失活的機(jī)制是由于啟動(dòng)子區(qū)CpG島的特異性高甲基化所致。雖然抑癌基因的失活也可由突變所致,但對(duì)該基因的研究結(jié)果顯示,RASSF1A的突變率還不及10%,而RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化的比率在小細(xì)胞肺癌、NSCLC細(xì)胞系中分別高達(dá)72%-100%、36%-88%,在NSCLC中啟動(dòng)子區(qū)高甲基化達(dá)30%-45%,同時(shí)非惡性組織肺組織中無(wú)一例發(fā)生甲基化。在研究中還發(fā)現(xiàn),RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與肺癌腫瘤細(xì)胞分化程度、開(kāi)始吸煙年齡有關(guān),本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相同。這一結(jié)果從側(cè)面證實(shí)了RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可能作為預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo),并且早期吸煙可能是造成RASSF1A表觀遺傳改變的分子事件。在對(duì)RASSF1A的大量研究中發(fā)現(xiàn),RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)極有可能也與腫瘤預(yù)后相關(guān)。RASSF1A甲基化狀態(tài)作為腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)在NSCLC中已有證實(shí)。Tomizawes等在對(duì)110例I期肺腺癌患者的研究中發(fā)現(xiàn),RASSF1A高甲基化與低生存率相關(guān),并且與腫瘤的低分化程度及血管和胸膜的侵犯高度相關(guān)。Kim等也發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化與I期、II期患者的預(yù)后均有關(guān)(P=0.02,P=0.01)。Endoh等發(fā)現(xiàn)在I期和II期術(shù)后肺癌患者中RASSF1A高甲基化與肺癌術(shù)后早期復(fù)發(fā)相關(guān)(P=0.0247)。但是也有1項(xiàng)對(duì)116例NSCLC的研究發(fā)現(xiàn),RASSF1A的甲基化狀態(tài)除了與腫瘤分化程度(P=0.024)和I期肺癌術(shù)后生存率(P=0.0276)有關(guān)外,與腫瘤的臨床特征(TNM分期、腫瘤復(fù)發(fā)、淋巴轉(zhuǎn)移和是否吸煙)及II期和III期肺癌術(shù)后生存期均無(wú)關(guān)(P>0.1)。進(jìn)一步利用Cox回歸模型分析,結(jié)果除了腫瘤分期是腫瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素外(P=0.0089),其它因素包括RASSF1A甲基化狀態(tài)在內(nèi)均與預(yù)后無(wú)關(guān)。因此RASSF1A甲基化并不能作為一個(gè)理想的肺癌預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。鑒于存在不同的研究結(jié)果,而國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)RASSF1A異常甲基化在肺癌預(yù)后中的文獻(xiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)分析150例NSCLC術(shù)后5年生存資料和RASSF1A甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)在I期、II期和IIIa期術(shù)后病人中,RASSF1A啟動(dòng)子高甲基化的病例生存率低于未發(fā)生甲基化的病例,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022,P=0.023,P=0.036)。IIIb-IV期的晚期NSCLC患者是否施行原發(fā)病灶切除需臨床謹(jǐn)慎判斷,本實(shí)驗(yàn)中也選取了21例IIIb-IV期的原發(fā)病灶行手術(shù)切除的NSCLC作為研究對(duì)象,其中RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化和未甲基化的病例生存期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.118),考慮由于研究例數(shù)較少且晚期肺癌患者后期治療影響因素較多,結(jié)果還有待進(jìn)一步研究。利用Cox模型進(jìn)行多因素分析,將與NSCLC有關(guān)的因素(年齡、性別、組織類(lèi)型、TNM分期、吸煙指數(shù)、開(kāi)始吸煙年齡等)進(jìn)行預(yù)后相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)除TNM分期外,RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)也是影響NSCLC術(shù)后生存期的一個(gè)獨(dú)立因素(RR=1.584,95%CI:1.040-2.411,P=0.032),這一結(jié)果與Tomizawa和Kim等報(bào)道結(jié)果相同。RASSF1A作為抑癌基因在抑制腫瘤發(fā)生中的作用越來(lái)越來(lái)受到研究者的關(guān)注。不斷有文獻(xiàn)報(bào)道,RASSF1A參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、穩(wěn)定微管等多種細(xì)胞生理功能。但其使RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)發(fā)生變化、引起基因失活的原因尚未完全清楚。本實(shí)驗(yàn)在較多人體肺癌組織標(biāo)本中檢測(cè)RASSF1A啟動(dòng)子甲基化狀態(tài),分析與肺癌臨床特征及預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)可以作為NSCLC術(shù)后的一個(gè)預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)。所取病例標(biāo)本為1999年-2000年北京胸部腫瘤結(jié)核病醫(yī)院胸外科進(jìn)行手術(shù)切除的150例NSCLC組織和20例肺部良性病變組織。手術(shù)切除組織標(biāo)本即刻-70oC低溫保存。每例腫瘤組織標(biāo)本均經(jīng)高倍境下確定腫瘤細(xì)胞≥80%。所有病例術(shù)前均未經(jīng)放療和化療。150例NSCLC病例中男性121例,女性29例;年齡為31歲-78歲,平均年齡為(59±9)歲;其中腺癌40例,鱗癌102例,腺鱗癌8例;根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的標(biāo)準(zhǔn):腫瘤TNM分期為I期49例,II期32例,IIIa期48例,IIIb-IV期21例,腫瘤分化程度為低分化62例,中分化58例,高分化30例。酚/氯仿抽提法。取1μg-2μg基因組DNA,加雙蒸水至50μL,加入5μL3mol/L的NaOH37oC變性30min;加入520μL新配制的3mol/L亞硫酸氫鈉(pH5.0)和30μL10mmol/L的對(duì)苯二酚,50oC保溫16h;純化回收DNA(Qiaquickgelextractionkit)。取亞硫酸氫鹽修飾后DNA1μL為模板,以經(jīng)SssI酶修飾的Hep-2細(xì)胞DNA為陽(yáng)性對(duì)照,水為陰性對(duì)照。引物由北京賽百盛生物公司合成并純化(表1)。采用沉降PCR和熱啟動(dòng)PCR。PCR反應(yīng)體系為25μL,模板DNA1μL,上下游引物各1μL,DMSO1.2μL,2×TaqPCRMasterMix(天根生化科技有限公司)12.5μL,最后加去離子水補(bǔ)齊至25μL。第一輪擴(kuò)增循環(huán)參數(shù):94oC3min后,94oC30s,46oC-53oC50s,72oC1min,27次循環(huán),72oC延伸10min。第二輪擴(kuò)增參數(shù):94oC3min后,94oC30s,58oC-65oC50s,72oC1min,37次循環(huán),72oC延伸10min。將25μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,然后在紫外線凝膠成像及分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司)下掃描拍照,記錄結(jié)果。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收(Qiaquickgelextractionkit),連接轉(zhuǎn)化涂板,挑取陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,相關(guān)性以χ2檢驗(yàn)和Fisher’s精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析;生存資料分析采用Kaplan-Meier法,各因素水平間比較用Log-rank分析,分析預(yù)后相關(guān)因素使用Cox回歸模型,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。150例NSCLC中58例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,發(fā)生甲基化率為38.7%;20例肺部良性病變中無(wú)1例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化(圖1)。150例NSCLC術(shù)后中位生存期為33個(gè)月,58例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為22個(gè)月,92例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為57個(gè)月(P=0.004)(圖2A);49例I期NSCLC術(shù)后中位生存期為80個(gè)月,13例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化,術(shù)后中位生存期為58個(gè)月,36例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為80個(gè)月(P=0.022)(圖2B);32例II期NSCLC術(shù)后中位生存期為32個(gè)月,12例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為24個(gè)月,20例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為80個(gè)月(P=0.023)(圖2C);48例IIIa期NSCLC術(shù)后中位生存期為23個(gè)月,24例RASSFA啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為18個(gè)月,24例未發(fā)現(xiàn)RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化,術(shù)后中位生存期為31個(gè)月(P=0.036)(圖2D);21例IIIb-IV期NSCLC中,9例RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)高甲