奶牛超數(shù)排卵的實驗研究

奶牛超數(shù)排卵的實驗研究

奶牛超數(shù)排卵是胚胎移植技術的重要因素之一。牛超數(shù)排卵的目的是最大限度地獲得受精卵和可用胚胎(Footeetal.,1986),然而,在實際生產中牛的超排反應和胚胎質量差異性很大。卵巢反應的差異性受許多因素的影響,如促性腺激素種類(Elsdenetal.,1978)、批號(Murphyetal.,1984)、處理時間(Lindselletal.,1986)、劑量(Pawlyshynetal.,1986)、季節(jié)(Masseyetal.,1984)、牛的品種(Saumandeetal.,1978)、年齡(Hasleretal.,1981)、處理時的卵巢生理狀態(tài)(Mooretal.,1984)、營養(yǎng)狀況(Hendricksetal.,1986)、繁殖史(Hasleretal.,1983)和重復超排次數(shù)(Donaldsonetal.,1983)等。超排就是在外源生殖激素作用下對母牛生殖系統(tǒng)所產生的一系列復雜生理過程。1發(fā)情周期的情況在自然狀態(tài)下,動物卵巢上約有99%的有腔卵泡發(fā)生閉鎖而退化,只有1%的能發(fā)育成熟而排卵。超數(shù)排卵的過程就是應用超過體內正常水平的外源促卵泡激素,使將要閉鎖的有腔卵泡發(fā)育成熟而排卵。實驗證明,動物有腔卵泡閉鎖之前,注射FSH或PMSG,能使大量卵泡不閉鎖而發(fā)育成熟;在排卵之前注射LH或HCG補充內源性LH的不足,可以保證大量成熟卵母細胞同時排卵,于是便形成了超數(shù)排卵。近年來,隨著人們對牛卵巢卵泡波動力學研究的進展,推動了對牛超數(shù)排卵的研究和應用。有些研究人員(Adamsetal,1984)已經闡述了FSH周期波,母牛每個情期由下丘腦釋放FSH2次或3次,相應的卵泡活動也有2個或3個波。在每個周期波期間,有一個卵泡將成為優(yōu)勢卵泡,它產生抑制素進一步抑制其它次級卵泡發(fā)育而使其閉鎖。而在卵泡發(fā)育期間用FSH處理,為一些卵泡提供了FSH,使其繼續(xù)生長發(fā)育,從而克服了由優(yōu)勢卵泡產生的抑制作用。如處在黃體期,優(yōu)勢卵泡最終退化形成閉鎖黃體,新的卵泡波又開始。實驗證明,大多數(shù)牛在發(fā)情周期中存在2~3個卵泡發(fā)生波。最典型的是在牛卵巢排卵后不久開始出現(xiàn)第1個卵泡波,8~10d后出現(xiàn)第2個卵泡波。對于有2個卵泡波的母牛來講,從第2個卵泡波中出現(xiàn)的優(yōu)勢卵泡將會排卵。而對于擁有3個卵泡波的母牛來講,在發(fā)情周期的18d從第3個卵泡波中出現(xiàn)的優(yōu)勢卵泡將會排卵。通常超排處理是在牛發(fā)情周期的8~12d(發(fā)情天為0d),最初這一時間是根據卵巢中卵泡波正處在成熟的時間來確定的。Lindsell等(1986)證明在發(fā)情周期的第9d開始超排比第3d、6d、12d時超排效果好,這一結果被最近的超聲波探測所證實,擁有3個卵泡波的母牛,第2個卵泡波正是在排卵后的第8.5d開始(發(fā)情的9.5d),而擁有2個卵泡波的母牛,是在排卵后的第9.5d開始,即發(fā)情的第10.5d開始。實際上,有2個卵泡波的母牛的發(fā)情周期(18~20d)比3個卵泡波的母牛的發(fā)情周期(21~23d)短。因此,通過以前發(fā)情周期的長短可為母牛選擇最佳的超排時間提供依據。無論擁有2個還是3個卵泡波的母牛,發(fā)情后8~12d是最有可能出現(xiàn)第3個卵泡波的時間(Gintheretal1989)。超排開始時間與新的卵泡波發(fā)生時間吻合時,超排反應最好(Nasseretal,1993)。2fsh及其類似物有三種不同的促性腺激素用于誘導母牛超排,即FSH,PMSG或馬絨毛膜促性腺激素(eCG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)。前列腺素(PGF2a)或其類似物,在超排程序中用于誘導黃體溶解,使母牛發(fā)情和排卵。豬垂體FSH是一種部分純化的提取物,其中含有FSH和LH成分。由于FSH在母牛體內的生物性半衰期估計為5h或更短(Laster等.,1972),所以,超排時必須每天注射2次(Chupin等.,1985)。通常的程序是遞減劑量連續(xù)4d或5d注射,每天兩次。處理開始后的48~72h,注射PGF2a消黃,36~48h內母牛發(fā)情并出現(xiàn)排卵前的LH峰,隨后24~36h后排卵(Diop等.,1988)。PMSG是具有FSH和LH活性的糖蛋白,已證明在母牛體內的半衰期為40h,動物體內存在達10d以上。在正常超排時注射一次,48h后注射PG。由于PMSG半衰期長,從而引起對卵巢的持續(xù)刺激,出現(xiàn)不排卵卵泡、內分泌異常和胚胎質量降低等現(xiàn)象(BoothWD1975)。在第一次輸精時(即發(fā)情后12~18h)靜脈注射PMSG抗體可緩解對卵巢的持續(xù)刺激。Monniaux等證明用FSH處理,平均排卵數(shù)及3個以上可用胚胎數(shù),高于PMSG處理。其他研究人員沒有發(fā)現(xiàn)FSH與PMSG的區(qū)別(Monniaux等,1983)。使用PMSG抗體對超排母牛起到明顯作用,超排效果與FSH沒有區(qū)別。一項研究表明一年內每隔60~90h重復超排,在超排反應、胚胎、卵子回收、受精或可用胚胎質量方面,二種不同的垂體提取物(Folltropin-V或FSH-P)和在第一次輸精時有或沒有注射PMSG抗體的PMSG處理均沒有差別(Mqpletoft等.,1990)。實驗證明商用FSH-P(豬源FSH)的生物活性以不同的批號、廠家等變化而變化(Lindsell等.,1986)。Mapletoft等利用生物活性為39~65μg/mg的FSH-P實驗發(fā)現(xiàn),在超排時,不同批號的FSH-P的差異大約是1個黃體,而相同的批號不同的試驗組變異性為2個黃體,這證明動物本身是差異的主要原因(XU等.,1988)。PMSG中的FSH和LH活性不僅母馬之間而且同一匹馬、不同的懷孕期也有不同。已證明不同批號的FSH-P的FSH/LH的比值有很大的變異性。FSH-P的活性從33.1ug/mg到349.8ug/mg,不同批號的FSH-P的FSH與LH的比值從0.20到4.42。在生產上,測定超排反應和胚胎生產的相關性時,不能證明5種不同制劑的FSH-P的區(qū)別(Lindsell等.,1986)?？傊?這些資料表明動物個體及環(huán)境是超排反應差異的主要因素。相對而言,含有低含量LH的高純度的垂體提取物能改善牛的超排效果。Chupin等(1984)利用450ug同等劑量的豬的FSH但不同含量的LH超排三組母牛,發(fā)現(xiàn)隨著LH含量的減少,平均排卵和回收及可用胚胎數(shù)量增加。當豬垂體提取物中的80%以上LH剔除后,可改善肉牛的超排效果(Willmott等.,1990)。用豬垂體粗提物或已剔除68%的LH對母牛超排,其效果明顯低于剔除84%或94%的LH的高純度垂體提取物。這一結果證明對肉牛來講FSH制劑中的LH影響其超排效果。FSH中的LH可接受的最大含量在15%和20%之間。隨著LH活性的增加,為獲得理想的超排效果,FSH劑量必須增加。Donaldson和Wad(1986)報道剔除FSH-P中的LH可提高母牛對促性腺素的反應效果,這樣就可減少為獲得最多的超排效果所需的FSH-P的量。在超排期間,由于高水平的LH可使排卵前卵子“未成熟激活”,從而影響胚胎的質量(Moor等.,1984)。在Mapletoft等的實驗中,利用高劑量的促性腺素超排清楚地證明LH的毒害作用。他們利用正常劑量的50%,100%,200%的HCG,FSH-P和Folltropin(FSH制劑)進行對比發(fā)現(xiàn),所測試的三種激素產品為100%~200%劑量之間,黃體數(shù)量沒有差異。Folltropin在100%~200%劑量間受精和可用胚胎數(shù)不變,但HCG和FSH-P組卻有明顯降低。綜上所述,高劑量的垂體促性腺激素對卵子和胚胎的毒害作用是由過高的LH引起的。動物個體的差異在超排反應中起主導作用。Chupin等(1985)報道,要想獲得高的超排效果,荷斯坦牛要求高比例的FSH,而夏洛來要求高比例的LH,也有報道證明在高溫條件下,高純度的Folltropin比FSH更有效,但在適宜的環(huán)境下,兩者間沒有區(qū)別(Page等.1989)。Mapletft等(2001)在阿根廷超排BOSINDICUS牛發(fā)現(xiàn),所有的垂體提取物在夏季都有效。此外,盡管冬季低溫對BOSINDICUS品種牛有應激反應,但是,高純度的垂體提取物對超排反應仍最有效(Tribulo等.1991)。因此,還需要今后提供更多的資料證明不同的條件下不同的個體和品種間的反應。一般認為成功地超排需要一定數(shù)量的LH。然而,用高純度的牛FSH每天兩次連續(xù)4d超排可獲得最高的超排效果(Chappel等.,1988;Looney等,1988)。受精率超過95%,胚胎可用率超過85%,這一結果在以后的大批量地超排牛得到證實(Wilson等.,1989)。從而證明超排試劑中不需要LH,用純FSH可能更好。BO等(1991)用提純的豬垂體提取物Folltropin一次大劑量超排供體母牛,皮下注射Folltropin劑量相當于400mg的FSH,其超排反應與一天兩次連續(xù)4d肌肉注射結果相同。然而,就荷斯坦牛采用肩部皮下注射比頸部更能獲得高的超排效果。肉牛對頸部注射的反應似乎與牛體狀況有關。事實上,任何增加Folltropin-V(肌注或瘦牛頸注)的吸收都會導致較低的超排反應和減少發(fā)情牛頭數(shù)。推測可能與過高劑量的LH有關。盡管Folltropin中的80%以上LH已經剔除,但當一次大劑量注射且吸收率太高時,殘留的LH還足以導致對黃體的刺激并阻止PGF2a對誘導黃體退化的作用?？傊?盡管動物個體對超排反應有較大的影響,但是就超排劑量而言,大劑量注射高濃度LH的促性腺激素對卵子或胚胎質量有明顯的毒害作用。因此,已清楚地證明高劑量的促性腺激素的毒害作用是由過高劑量的LH所引起。剔除LH后的純垂體促性腺激素有較寬的激素適應范圍。3發(fā)情周期的超排母牛發(fā)情后8~12d,以遞減劑量肌注FSH,連續(xù)4d或5d,在FSH開始注射后的48h或60h肌注一次或兩次PGF2a。在發(fā)情周期的中期超排效果好只是一種經驗積累(Bo等.,1995)。并沒有評價超排時母牛卵巢卵泡的生理狀態(tài)?，F(xiàn)在通過超聲波了解到,不論是擁有2個或3個卵泡波的母牛,發(fā)情后8~12d是最大可能出現(xiàn)第2個卵泡波的時間(Ginther等.,1989)。然而,有2個或3個卵泡波的母牛,其第2個卵泡波出現(xiàn)的時間不同(擁有3個卵泡波的母牛第2個卵泡波出現(xiàn)的時間提前1~2d),具有相同的卵泡波但不同個體第2個卵泡波出現(xiàn)的時間也有差別(Ginther等.,1989)。已清楚地證明當超排處理的時間與新的卵泡波出現(xiàn)的時間相吻合時,超排反應最好(Nasser等.,1993)。即使超排處理比卵泡波出現(xiàn)的時間晚1d也會使超排效果明顯下降(Adams等.,1994)。根據優(yōu)勢卵泡在2個或3個卵泡波中的生長情況,在任何時間內優(yōu)勢卵泡不是功能優(yōu)勢卵泡的可能性為30%(有2個卵泡波的育成牛20d中的6d),和35%(有3個卵泡波的育成牛23d中的8d)。更重要的是,發(fā)情周期中大約只有20%(4~5d)時間利于開始超排(新的卵泡波出現(xiàn)時間),因此,發(fā)情期中的80%的時間不適合超排。只有母牛發(fā)情周期的中期開始超排效果最佳。據報道,在母牛發(fā)情的任何時間,將孕酮或孕激素裝置放入母體,同時注射5mg17-β雌二醇和100mg孕酮,4d后FSH超排處理,48h后注射PGF2a,12h后取出孕酮或孕激素裝置,其與傳統(tǒng)的超排方法和超排效果相同(Bo等.,1997)。不考慮母牛發(fā)情周期的情況下,通過利用外源性激素控制卵泡波,可使超排開始的時間正好是新的卵泡波出現(xiàn)的時間。供體母牛必須是產后最少50d的牛,而且發(fā)情周期正常、具有合理的營養(yǎng)水平,并有一個體重增加的過程。超排前可添加飼喂一些礦物質。盡管沒有看到明顯的效果,但有資料表明,添加螯合物可改善超排效果和增加胚胎數(shù)量。擁有超排反應成功歷史的母牛、無不孕史的母?；虍a過雙胎的母?？赡苡泻玫某判ЧＵＧ闆r下,超排是在母牛發(fā)情周期的8、9或10d開始,3d和14d前也能獲得成功,但效果不佳。實踐證實母牛發(fā)情周期的長短為最適宜的開始超排時間提供了參考依據。擁有21~23d發(fā)情周期的母牛應在第9d超排,而對于18~20d發(fā)情周期的母牛必須在第10d超排。從卵泡波開始即使是1d的差異也會對超排反應有影響。如果母牛沒有正常的發(fā)情周期或發(fā)情周期不詳,可耳埋含有6mg孕酮的Syncro-Mate-B同時注射3mgNorgestomet和5mg的雌二醇。通常超排是在耳埋植后的5~6d開始,60h后除去(PGF2a處理后12h)。PRID和CIDR也可用于孕酮的來源。有證據表明