人白細(xì)胞蛋白質(zhì)提取及雙向電泳分析方法的初步研究

人白細(xì)胞蛋白質(zhì)提取及雙向電泳分析方法的初步研究

蛋白質(zhì)組是指由細(xì)胞或組織的全部相應(yīng)蛋白質(zhì)組成的組。這一概念是由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams于1994年提出,并最早見于1995年7月的“Electrophoresis”雜志上。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是以蛋白質(zhì)組為研究對象,是在蛋白質(zhì)多肽譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的,是在動態(tài)水平上通過對蛋白質(zhì)進(jìn)行測定,來闡述環(huán)境、疾病、藥物等對細(xì)胞代謝的影響,并分析其主要作用機(jī)理,解釋基因表達(dá)的主要形式。而雙向電泳技術(shù)(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù),目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種正常和腫瘤組織蛋白質(zhì)圖譜的建立和特異性標(biāo)志物的篩選研究。白細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、酸性粒細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)作為機(jī)體的特異性、非特異性免疫反應(yīng)以及變態(tài)反應(yīng)的主要細(xì)胞,關(guān)于它的基礎(chǔ)和臨床方面的研究很多,但對其進(jìn)行蛋白質(zhì)組方面的研究工作尚未見公開報道,本研究建立了人白細(xì)胞蛋白質(zhì)提取及雙向電泳的方法,為構(gòu)建白細(xì)胞在不同生理或病理條件下的蛋白質(zhì)表達(dá)譜或進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的差異分析奠定基礎(chǔ)。1試劑和儀器丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、尿素、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、過硫酸銨、CHAPS、TBP、線性固相pH梯度預(yù)制膠條(pH4～7)、礦物油均購自Bio-Rad公司;DMEM購自GIBCO公司;新生小牛血清購自成都市華星生物化學(xué)制品廠;Dextron-T500購自Pharmacia公司;考馬斯亮蘭G-250、考馬斯亮蘭R-250購自sigma公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.2溶液配制11細(xì)胞分解溶液8M尿素,1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-lyte,-20℃保存。2樣品水化劑8M尿素,1%DTT,4%CHAPS,0.5%Bio-lyte,-20℃保存。3sds/甘油溶液6M尿素,0.375MTris(pH8.8),2%SDS,20%甘油,-20℃保存。平衡緩沖液應(yīng)用液a:臨用前加2%DTT。平衡緩沖液應(yīng)用液b:臨用前加2.5%碘乙酰胺。41固染料測試溶液10%冰乙酸,40%乙醇,10%甲醇。5染色溶液10%冰乙酸,40%乙醇,10%甲醇,0.25%考馬斯亮蘭R-250(W/V)。6儀器和檢測方法7%冰乙酸,5%甲醇1.2儀器主要設(shè)備包括5417R高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司),PROTEINIEFcell,PROTEINⅡXI2-DCell,GelAirDryingSystem,1022PLUS雙向凝膠電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),UV-1100紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)。2實驗方法2.1分離細(xì)胞ron取外周血25ml,加入等量3%Dextron,緩慢顛倒混勻,室溫靜置30min,取上層液體(內(nèi)含白細(xì)胞),加適量PBS洗滌2～3次,1300轉(zhuǎn)/分離心收集細(xì)胞。2.2凍融法提取細(xì)胞蛋白在收集的白細(xì)胞中加入5倍體積的細(xì)胞裂解液,反復(fù)吹打并于-80℃反復(fù)凍融3次,12000轉(zhuǎn)/分離心60min,上清液即為白細(xì)胞蛋白裂解液,用考馬斯亮蘭G-250法測得蛋白樣品濃度,-70℃保存?zhèn)溆谩?.3ipg膠條電泳根據(jù)所測樣品濃度取上述樣品500μg加入水化緩沖液至總體積350μl,轉(zhuǎn)移到水化槽中。取預(yù)先平衡至室溫的IPG膠條一條,膠面向下放入水化槽,表面加礦物油覆蓋,20℃水化過夜。然后將水化溶脹的IPG膠條轉(zhuǎn)移入一向等電聚焦電泳槽中按下述步驟進(jìn)行電泳:0～250V,30min;1000V,1h;1000～10000V,5h;10000V,6h;500V,20min,電泳總伏時數(shù)為88367。2.42向sds-gas2.4.1含碘乙酰胺的平衡緩沖液的t電泳完畢后取出膠條膠面向上置于含DTT的平衡緩沖液中平衡15min,然后再置于含碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡15min,取出后吸去膠條表面多余的液體。2.4.2凝膠的二維實驗將平衡好的膠條以膠條背面緊貼玻璃板的方式放入預(yù)先制備好的SDS凝膠中,膠條下部緊貼凝膠上表面,再加入0.5%的瓊脂糖凝膠封閉空隙,加入電極緩沖液,進(jìn)行二向電泳。10mA電泳15min后加大電流至20mA直至溴酚藍(lán)前沿距離玻璃板下緣0.5cm時停止電泳。2.5決定的顏色和保存取出凝膠,按文獻(xiàn)所述方法用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,染色完畢后,用玻璃紙覆蓋凝膠,放入干膠儀中干膠,并照相保存結(jié)果。3結(jié)果3.1全細(xì)胞蛋白雙向電泳以pH4～7的IPG膠條為一向進(jìn)行等電聚焦,以SDS作為二向進(jìn)行垂直電泳,按上述步驟對白細(xì)胞裂解蛋白進(jìn)行電泳,最后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色得到的全白細(xì)胞蛋白雙向電泳圖譜,見附圖。4后基因組中白領(lǐng)的檢測白細(xì)胞是機(jī)體的主要免疫細(xì)胞,主要參與機(jī)體的各種特異性、非特異性免疫以及變態(tài)反應(yīng),白細(xì)胞功能異?？梢砸鸲喾N自身免疫性疾病,而白細(xì)胞的惡變可導(dǎo)致各種白細(xì)胞性白血病,因此長期以來人們就運(yùn)用多種方法對白細(xì)胞進(jìn)行研究。隨著后基因組時代的到來,可以運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)來進(jìn)行白細(xì)胞的研究,而首要任務(wù)就是建立一種有效的白細(xì)胞蛋白提取和雙向電泳方法。本實驗以pH4-7的IPG膠條為一向進(jìn)行等電聚焦,以SDS作為二向進(jìn)行垂直電泳,對白細(xì)胞裂解蛋白進(jìn)行電泳,然后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色得到較為滿意的全白細(xì)胞蛋白雙向電泳圖譜,并用PDQuest2D分析軟件和SWISSSPORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對該圖譜進(jìn)行了初步分析,具體討論如下。4.1選擇糖溶解度及影響等電聚焦的雜質(zhì)在雙向電泳中樣品處理的好壞會影響到最終實驗結(jié)果的分辨率及重復(fù)性,是雙向電泳成功的關(guān)鍵步驟。樣品的處理要在盡量提高蛋白溶解度的基礎(chǔ)上,減少各種可能影響等電聚焦的鹽離子、核酸等雜質(zhì)。因此,我們采用密度梯度離心的方法分離白細(xì)胞,并用反復(fù)凍融法使白細(xì)胞裂解,這樣就減少了其它干擾等電聚焦的因素影響。此外在提高蛋白質(zhì)溶解性方面,用三正丁基膦(TBP)代替常規(guī)方法所用的DTT,可大大提高蛋白質(zhì)溶解度并促進(jìn)蛋白質(zhì)從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移,取得了良好的效果。4.2ipg膠條電泳傳統(tǒng)的一向等電聚焦是用載體兩性電解質(zhì)為基礎(chǔ)的圓盤電泳來進(jìn)行,但存在較多缺陷,包括:載體兩性電解質(zhì)形成的pH梯度較窄且不連續(xù),存在陰極漂移現(xiàn)象,因兩性電解質(zhì)的生產(chǎn)批次不同而影響實驗的重復(fù)性等缺點(diǎn)。在本實驗中我們采用的是固定干膠條技術(shù)(IPG技術(shù))。運(yùn)用IPG技術(shù)進(jìn)行一向電泳,操作簡便,并且避免了傳統(tǒng)的以載體兩性電解質(zhì)為基礎(chǔ)的等電聚焦帶來的缺陷,而且IPG膠條有不同的長度和pH范圍,可以根據(jù)具體的分離要求選取不同型號的膠條。在預(yù)實驗中我們發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞蛋白的pI大多在pH5～7的范圍內(nèi),因此我們選用pH4～7長17cm的IPG膠條進(jìn)行一向電泳,可以提高電泳分析的分辨率。本實驗中樣品的水化采用被動水化的方式,并以250V低電壓電泳30分鐘,可以除去膠條中的鹽離子,然后逐漸升高電壓,電泳總伏時數(shù)達(dá)到60000VH以上即可達(dá)到充分聚焦的目的。4.3向sds雜志通過對不同實驗條件的篩選,本實驗采用分離膠濃度10%,Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng),在20℃,20mA電流進(jìn)行電泳取得了較好的分離效果。4.4核心細(xì)胞系統(tǒng)的染色電泳完畢之后,根據(jù)不同的上樣量和不同實驗所要求的分辨率,可以選用不同的染色方法進(jìn)行染色,常用的染色方法有:考馬斯亮藍(lán)(coomassiebrilliantblue,CCB-250)染色,銀染法,以及SYPRORUBBY染色法。本實驗因為是對白細(xì)胞蛋白作一常規(guī)的雙向電泳分析,故采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行染色,同樣取得了理想的染色效果。染色完畢后的凝膠,經(jīng)干膠儀干膠后可長期保存。為了進(jìn)行進(jìn)一步的痕量蛋白的分析,在后續(xù)實驗中我們還將進(jìn)行銀染法染色,以獲得更多點(diǎn)和分辨率更高的白細(xì)胞蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。4.5纖維初始鑒定獲得的電泳圖譜可運(yùn)用ImageMaster2D和PDQuest等軟進(jìn)行分析處理,對于不同的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)可根據(jù)其pI和MW通過SWISSSPORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行初步鑒定,對感興趣的點(diǎn)可應(yīng)用Westernblotting、質(zhì)譜甚至氨基酸序列分析等方法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。綜上所述,本實驗建立了人白細(xì)胞蛋白質(zhì)的雙向電泳分析方法,并對電泳圖譜進(jìn)行了初步分析。整塊膠染色效果好、本底淺,各點(diǎn)分離清晰,無明顯橫向或縱向拖尾,能滿足2-DE專業(yè)軟件分析的要求,為