干細胞睪丸生精小管移植的模型研究

干細胞睪丸生精小管移植的模型研究

據(jù)統(tǒng)計，世界上80000名婦女遭受了懷孕和不育，其中50%是由丈夫引起的。卵細胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射技術(shù)(ICSI)的建立與睪丸顯微取精技術(shù)的逐步發(fā)展,使某些原發(fā)性無精子癥(又稱非梗阻性無精子癥,NOA)患者有了生育子代的可能。但是對于大多數(shù)NOA患者而言,用自己的精子生育出健康的子代仍然只是一個美好的愿望。自從1994年Brinster和他的同事建立了小鼠睪丸生精細胞移植技術(shù)以來,該技術(shù)已成為眾多科研人員用來研究精子發(fā)生機制這一復(fù)雜過程的有力工具。1995年Jiang等報道了大鼠個體之間成功的精原干細胞移植,隨后小鼠和大鼠之間的移植也相繼獲得成功。直至2006年Nayernia等用該技術(shù)獲得的胚胎干細胞來源的雄性配子成功地生育出子代小鼠,這些成果無一不與移植技術(shù)的建立有著密不可分的關(guān)系。要想獲得移植的成功,移植受體模型的建立和移植方法改進是兩個非常關(guān)鍵的因素。關(guān)于移植受體模型的建立,目前已經(jīng)有很多方法:化療法、放療法、轉(zhuǎn)基因法、外科手術(shù)法、激素法等,這些方法中有的比較復(fù)雜昂貴,有的不穩(wěn)定。本實驗主要通過不同劑量的白消安(Busulfan)腹腔單次注射的方法探索無精子癥小鼠模型的建立。關(guān)于生精小管干細胞移植的方法與技術(shù),一般參照Ogawa等于1997年所建立的一套系統(tǒng)。我們對注射裝置進行了自主設(shè)計和技術(shù)改進,并申報專利。本課題試圖建立簡單易學(xué)、適于推廣的移植技術(shù),為干細胞向雄性配子發(fā)育的研究奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1干預(yù)移植受體模型的構(gòu)建1.1.1材料表面1.1.1.物中心物中心清潔型雄性ICR小鼠(購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心)共60只,6～8周齡,分為A、B、C、D4組,每組15只。動物飼養(yǎng)及使用按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心實驗動物倫理委員會規(guī)定執(zhí)行。1.1.1.2試劑白消安(Sigma產(chǎn)品),生理鹽水,二甲亞砜(DMSO,Sigma產(chǎn)品)。1.1.2方法1.1.2.冰冰冰用DMSO將白消安配制成25mg/ml的貯存液保存于-80℃冰箱備用。配制工作液時先用生理鹽水將DMSO稀釋為50%,再用此50%的DMSO將貯存液稀釋為5mg/ml的工作液,置于37℃水浴中防止其凝固。1.1.2.體重和注射d組腹腔單次注射上述工作液,A組劑量為15mg/kg體重,B組劑量為30mg/kg體重,C組劑量為40mg/kg體重,D組為對照組,注射等體積的50%DMSO。注射后常規(guī)飼養(yǎng),每日觀察小鼠的存活情況。1.1.2.睪丸生精細胞中空率的檢測分別于注射后4、8、12周各取上述4組小鼠每次5只處死,取出雙側(cè)睪丸稱重,然后將其放入Bouin液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,普通光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸生精上皮的改變,統(tǒng)計生精小管的中空率,每張切片計數(shù)30～100個生精小管,沒有各級生精細胞的生精小管視為中空。1.2干預(yù)移植方法的改進1.2.1材料表面普通50ml注射器2個,三通管2個,橡膠管、閥門、口含器各1個,旋鈕式微量注射器1個,1mm直徑的玻璃穿刺針1根。1.2.2方法1.2.2.1各種組件的連接如圖1所示。1.2.2.空氣進入接口系數(shù)d①關(guān)閉F,用A1抽吸細胞懸液到穿刺針上所需刻度;②打開F,邊穿刺邊通過E試探性地注射,一旦發(fā)現(xiàn)有液體進入生精小管即關(guān)閉F;③此時可先用A1注射(液體較多時),或者直接轉(zhuǎn)動D用A2注射(視具體情況而定),但當臨近液體注射完時一定要用A2注射,防止過快造成空氣進入;④注射完畢。2結(jié)果2.1白色消毒對大鼠生存的影響白消安處理后的第16天,C組有1只小鼠死亡,其后各組小鼠均未出現(xiàn)死亡。各組之間小鼠死亡率無顯著性差異(P>0.05)。2.2兩組12周時f、c、p之間的關(guān)系見圖2。白消安處理后4、8周,B、C組小鼠的平均睪丸重量顯著低于D組(P<0.05),12周時與D組差異不大(P>0.05),而B、C兩組之間無顯著性差異(P>0.05)。A組只是在4周時小鼠睪丸重量顯著低于D組(P<0.05),而8和12周時小鼠睪丸重量與D組相比均無顯著性差異(P>0.05)。2.3多層生精細胞的生長白消安處理后4、8周時C組的生精小管中空率分別為80.45%、67.33%,顯著高于其他各組(P<0.05);B組4、8周的中空率也都在50%以上,顯著高于A組(P<0.05)。A組在整個處理過程中生精小管的結(jié)構(gòu)改變不大,只是在4周時有少部分生精小管中空,8、12周時已經(jīng)基本恢復(fù)到正常狀態(tài);B組在4周時生精小管均大面積中空,各級生精細胞消失,只能見到少量的精原細胞,8周時已有部分生精小管可見多層生精細胞,但精子細胞未見;C組在4、8周時的情況與B組相似但更加嚴重,可以看到有些管腔結(jié)構(gòu)紊亂、塌陷;D組一直可見各級生精細胞。見圖3。2.4雙側(cè)睪丸的注射將消化后的干細胞制備成1～3×107/ml的細胞懸液,用改進后的注射裝置經(jīng)輸出小管進行注射,成功率可達90%以上,再加上細胞損失較少,注射雙側(cè)睪丸(注射面積60%以上)僅需細胞懸液50μl左右,并且注射速度較快,一側(cè)睪丸10min左右即可完成。本設(shè)計已申請實用新型專利,申請?zhí)?200920066863.3(見圖4)。3小鼠干細胞移植實驗干細胞是一種能夠不斷地進行自我增殖和具有多向分化能力的細胞,這種細胞是科學(xué)家未來用于治療許多疾病的希望,也是生殖醫(yī)學(xué)家們用來治療難治性不育癥的愿望。目前誘導(dǎo)干細胞向精子分化主要有兩條途徑:體外誘導(dǎo)和體內(nèi)誘導(dǎo)。體外誘導(dǎo)難度較大,且體外易受到各種因素的干擾,穩(wěn)定性較差;而體內(nèi)誘導(dǎo)是將生精干細胞移植到睪丸內(nèi),使這些干細胞在精子發(fā)生的天然微環(huán)境內(nèi)向精子分化,這無疑比體外誘導(dǎo)有更大的優(yōu)越性。為了提高生精干細胞移植的成功率,理論上認為先需要清除內(nèi)源性的干細胞,為植入的干細胞提供一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境(niche)。雖然目前建立這種移植受體模型的方法有多種,但是用的最多、相對簡單的方法還是白消安腹腔單次注射法。由于運用此方法時,不同的動物品系與不同的注射劑量所得到的結(jié)果不同,動物的死亡情況也不同,所以本實驗的主要目的就是要摸索出一個適合本實驗的小鼠品系及給藥方法,以獲得一個穩(wěn)定可靠的移植受體模型。從實驗結(jié)果看,A組雖然在4周時睪丸重量變化較D組明顯,但生精小管上皮結(jié)構(gòu)的變化不能滿足作為移植受體模型的需要,盡管在4周時相當比例的生精小管中空,但是比例較小,且維持時間較短,8周時已恢復(fù)到接近正常的狀態(tài),所以15mg/kg體重的劑量不能滿足模型的需要。B、C兩組在4、8周時的睪丸重量均有顯著的減輕,而這與此時兩組的生精小管中空率(均在50%以上)以及光鏡下看到的上皮結(jié)構(gòu)也是吻合的,說明此時睪丸內(nèi)的精子發(fā)生受到影響,內(nèi)源性的精子發(fā)生處于抑制階段。而此后12周時內(nèi)源性的精子發(fā)生逐漸恢復(fù),說明該無精子癥的模型是可逆的。同時也應(yīng)當看到,所有組別的小鼠中只有C組出現(xiàn)1只死亡,并且4周時的石蠟切片除了可以看到大面積中空的生精小管外,還有很多生精小管管腔結(jié)構(gòu)紊亂,甚至塌陷,說明40mg/kg體重的劑量對該品系小鼠有較大的毒性,對睪丸的生精功能損害較大,不利于干細胞在生精小管內(nèi)存活及向雄性配子的分化。綜上所述,我們推薦30mg/kg體重劑量的白消安單次注射于ICR小鼠的腹腔內(nèi),4周后所得的精子發(fā)生障礙模型是可靠的,適合作為生精干細胞移植的模型。改進后的干細胞移植方法主要有以下優(yōu)點:①由于采用邊穿刺邊從口含器端試探性地進行注射的方法,從而使注射的成功率達90%以上,減少了細胞的浪費,注射雙側(cè)睪丸僅需約50μl細胞懸液即可使面積達60%以上;②口含器端注射成功后即用注射器加壓注射,與單純口吹法相比縮短了注射時間,減少了操作人員體力的浪費,并且可以使注射面積的選擇范圍更大(0～100%);③可使用注射器A抽吸液體,這樣省時