黃曲霉毒素標準檢測規(guī)程

黃曲霉毒素原則操作規(guī)程1、目的為了規(guī)范親和柱凈化樣本中黃曲霉毒素的操作流程,特制訂本操作規(guī)程。2、范疇本原則合用于糧食、飼料、中藥中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測。3、檢出限和定量限項目島津安捷倫樣本檢出限(μg/kg樣本定量限(μg/kg樣本檢出限(μg/kg樣本定量限(μg/kgAFG10.120.40.93.0AFG20.080.20.30.86AFB10.080.20.61.97AFB20.040.120.20.634、職責部門名稱部門職責質(zhì)量管理部1、負責本制度的實施。2、負責本制度的監(jiān)督執(zhí)行。5、程序5.1原理測定的基礎是抗原、抗體反映,抗體連接在柱體內(nèi),樣品中的黃曲霉毒素B1通過提取、過濾、稀釋,然后緩慢的通過黃曲霉毒素B1免疫親和柱,在免疫親和柱內(nèi)毒素與抗體結(jié)合,之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其它無關物質(zhì)。用甲醇洗脫黃曲霉毒素B1,然后注入到分析儀器中用于檢測。5.2溶液配制5.2.170%甲醇-水溶液:取700mL甲醇,加入300ml去離子水混勻即可。5.2.280%乙腈-水溶液:取800m乙腈,加入200ml去離子混勻即可。5.2.31%吐溫-水溶液:取1ml吐溫-20,加入去離子水并定容至100ml。5.2.4黃曲霉毒素混合原則工作液:用色譜級甲醇將儲藏工作液分別稀釋到50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml。5.3樣品前解決5.31合用于玉米、小麥等糧食作物,花生及其制品,堅果、玉米油、花生油、飼料等樣品----25g±0.01g樣品(固體樣品需粉碎,并過2mm分樣篩,加入5g氯化鈉與125mL70%甲醇-水溶液混勻;----高速均質(zhì)(≥10,000r/min1min,或搖床(200r/min~300r/min激烈振蕩20min,用快速定性濾紙過濾,收集濾液;----取10mL濾液加入20mL蒸餾水稀釋,再用微纖維濾紙過濾,并收集濾液作為上樣液;----取15mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù):15.3.2合用于辣椒、花椒、黃豆醬等調(diào)料,面粉、麥芯粉、芝麻油及其它植物油、谷草等樣品----25g±0.01g樣品(固體樣品需粉碎,并過2mm分樣篩加入125mL80%乙腈-水溶液混勻;----高速均質(zhì)(≥10,000r/min1min,或搖床(200r/min~300r/min激烈振蕩20min,用快速定性濾紙過濾,收集濾液;----取10mL濾液加入40mL蒸餾水稀釋,再用微纖維濾紙過濾,并收集濾液作為上樣液;----取25mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù):15.3.3合用于中藥(版藥典規(guī)定的19味中藥等----15g±0.01g樣品(固體樣品需粉碎,并過2mm分樣篩加入75mL80%乙腈-水溶液混勻;----高速均質(zhì)(≥10,000r/min1min,或搖床(200r/min~300r/min激烈振蕩20min,用快速定性濾紙過濾,收集濾液;----取10mL濾液加入40mL1%吐溫-水溶液,再用微纖維濾紙過濾,并收集濾液作為上樣液;----取25mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù):15.3.4合用茶葉樣品:----10g±0.01g加入2g氯化鈉,加入純甲醇溶液100mL,混勻;----高速均質(zhì)(≥10,000r/min均質(zhì)1min,或搖床(200r/min~300r/min激烈振蕩20min,用快速濾紙過濾,收集濾液;----取10mL濾液加入40mL蒸餾水稀釋,再用微纖維濾紙過濾,并收集濾液作為上樣液;----取25mL上樣液過免疫親和柱凈化。稀釋倍數(shù):25.4凈化----取出免疫親和柱,將上方塞子取出斜剪斷,再插回親和柱上;(3mL的免疫親和柱去掉上方塞子,安裝上轉(zhuǎn)接頭,將轉(zhuǎn)接頭另一端與注射器固定后使用----將柱子與氣控操作架上的注射器連接固定,取適量解決后的溶液上樣;----去掉親和柱下方堵頭,調(diào)節(jié)開關,使液體以1~2滴/秒的速度流出;----待液體排干后,用10mL去離子水洗滌2次,流速2~3滴/秒;對于顏色附著比較深的樣品,先用1%Tween-20水溶液洗滌10mL,再用蒸餾水或去離子水洗滌10mL流速2~3滴/秒;----待液體排干后,上樣1mL甲醇,流速1滴/秒,收集洗脫液并定容至1mL;----洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析。*每次上樣前都要將上次液體完全排干。5.5液相測定5.5.1液相色譜條件C18柱:250mm(長×4.6mm(直徑,填料粒徑5μm;流動相:55%甲醇(AFB1;53%甲醇(AFT流速:0.8mL/min;柱溫:40℃;進樣體積:20μL熒光檢測器:激發(fā)波長:360nm;發(fā)射波長:440nm;5.5.2色譜定量分別取相似體積樣液和原則工作液注入高效液相色譜儀,在上述色譜條件下測定試樣的響應值(峰高或峰面積,以原則品濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標做原則曲線,將未知樣本中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的峰面積帶入原則曲線,得到試樣中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的濃度,原則品色譜圖參考下圖:數(shù)據(jù)文獻名:AFT-B1-10ppb.lcd樣品名:AFT-B1-10ppb0.02.55.07.510.012.515.017.5minmV檢測器AEx:360nm,Em:440nmAFG2AFG1AFB2AFB15.6注意事項----使用前,免疫親和柱需回至室溫(22~25℃。----親和柱2~8℃儲存,不得凍存。----不要使用過了有效日期的免疫親和柱。----取樣量:根據(jù)需要能夠適宜增加或減少取樣量,注意提取液量要對應變化。----柱容量:300ng,當樣本中待檢毒素的含量除以稀釋倍數(shù)高于柱容量時,需要適宜降低上樣液的體積,重新檢測。----pH:親和柱的上樣溶液pH需在6~8之間,若偏離此范疇需要用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。----上機檢測時的溶劑與流動相保持一致能夠消除溶劑效應的影響。----黃曲霉毒素B1可致癌,應戴手套操作。----使用過的容器及黃曲霉毒素B1溶液最佳用次氯酸鈉溶液(5%V/V浸泡過夜。6、有關文獻《免