三葉蟲茶水提液和丙酮提取物中總糖含量測定

三葉蟲茶水提液和丙酮提取物中總糖含量測定

三名秋海棠的葉子在春天飼養(yǎng)了大米酪氨酸酶，并將其用作藥物或茶。它在中國湖南和廣西廣泛傳播了數(shù)百年。在當(dāng)?shù)乇环Q為“昆蟲茶”，俗稱“三葉昆蟲茶”。研究表明,三葉蟲茶的水提液和丙酮提液對大鼠的潰瘍性結(jié)腸炎有顯著效果,對腎性高血壓大鼠神經(jīng)免疫具有調(diào)節(jié)作用。有的多糖也具有抗?jié)冏饔?而蟲茶中多糖含量的測定未見報道。本文采用蒽酮-硫酸比色法對三葉蟲茶水提液和丙酮提取物中的總多糖進行了含量測定,為其藥效學(xué)研究打下基礎(chǔ)。1儀器和試劑盒1.1溫水浴鍋設(shè)備UV-2450型紫外-可見分光光度儀(日本島津);HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金域國勝實驗儀器廠);MET-TLERTOLEDOAE200S分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);SK3300H超聲清潔儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。1.2葉蟲茶-酮的制備葡萄糖對照品(中國藥品生物制品檢定所,供含量測定用,批號110833-200302);蒽酮,濃硫酸,丙酮,乙醇均為分析純;水為重蒸餾水;三葉蟲茶(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護系文禮章博士提供)。蒽酮-硫酸溶液精密稱取蒽酮50mg,加入蒸餾水25mL,緩慢加入98%濃硫酸75mL,邊加邊攪拌,直至蒽酮溶解,冷卻至室溫后使用(臨用新配);硫酸溶液:不加蒽酮,其余按蒽酮-硫酸溶液配制。2方法和結(jié)果2.1葡萄糖濃度的確定對照品貯備液A:精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品0.8775g,置250mL量瓶中,加水使溶解,稀釋至刻度,搖勻,即得(葡萄糖濃度為3.51mg/mL)。對照品溶液A:精密量取對照品溶液貯備液5mL,置50mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,即得(葡萄糖濃度為0.351mgmL)。對照品溶液B:精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品69.2mg,置200mL量瓶中,加80%乙醇溶解,稀釋至刻度,搖勻,即得(葡萄糖濃度為0.346mg/mL)。2.2試驗溶液的制備2.2.1葉蟲茶提取物的提取將三葉蟲茶研磨過40目篩后,精密稱取粉末0.500g,精密加水50mL,稱定質(zhì)量,90℃水浴回流1h,冷卻,再稱定質(zhì)量,加水補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液10mL,置50mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,即得。2.2.2丙酮提取物的供試品溶液(下稱供試品溶液B)稱取三葉蟲茶1kg(分成10份),用6倍量丙酮超聲提取3次,每次60min,濾過,合并3次濾液,回收丙酮,90℃水浴干燥得總固體12.00g。精密稱取25mg,用80%乙醇溶解并定容至25mL的容量瓶中,即得。2.3最大吸收波長測定精密量取同一供試品溶液0.5mL2份,分別置于具塞的10mL的刻度管中,分別精密加水(或80%乙醇,指供試品溶液B)至1mL,在冰水浴中,1份緩慢精密加入蒽酮-硫酸溶液4mL,另1份緩慢精密加入硫酸溶液4mL,分別搖勻,放置20min,于90℃水浴中加熱25min,然后常水冷卻至室溫,分別以另1份(供試品空白)為參比,于550~700nm波長之間進行掃描。測得供試品溶液A和B顯色后的最大吸收波長均在(620±5)nm,見圖1(1)。用對照品溶液A和B同上操作,以試劑空白和對照品空白為參比,測得對照品溶液A和B顯色后的最大吸收波長均在(620±5)nm,而且使用試劑空白和對照品空白為參比,測得同一對照品其吸收曲線重迭,但是測定80%乙醇作溶劑的對照品溶液時,靈敏度更高。故選620nm為測定波長,標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時可采用試劑空白為參比,見圖1(2)。2.4總酮-硫酸分光光度法精密量取對照品溶液A(或?qū)φ掌啡芤築)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL,分別置于具塞的10mL試管中,各精密加水(或80%乙醇,指對應(yīng)對照品溶液B)至1mL,在冰水浴中緩慢精密加入蒽酮-硫酸溶液4mL,搖勻,20min后置于90℃水浴中加熱25min,水冷卻至室溫,然后以0mL管溶液為空白,在620nm波長處測定吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度(X)為橫坐標(biāo)進行線性回歸,得回歸直線方程分別為:對照品溶液AY=0.0276X-0.047,r=0.998(n=6)對照品溶液BY=0.0379X+0.024,r=0.996(n=6)葡萄糖在7.0~42μg/mL范圍內(nèi)均具有較好的線性關(guān)系。2.5rsd測定分別精密量取兩種供試品溶液0.5mL各2份,按“2.3”項下方法顯色后,分別于20、30、40、50、60min時測定620nm波長處各吸光度,結(jié)果1h內(nèi)兩種供試品溶液的吸光度基本無變化,即RSD分別為1.8%、1.9%(n=5)。2.6樣品取樣性能2.6.1水溶液回收率測定稱取已知含量(9.51%)的三葉蟲茶樣品粉末(0.500±0.001)g,共6份,分別每3份各精密加入13mL和15mL對照品貯備液A,按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液,并按“2.3”項下方法操作,以供試品空白為參比,在620nm波長處測定吸光度,計算水溶性總糖的回收率,結(jié)果見表1。2.6.2對照品溶液的制備精密稱取已知含量(13.4%)的三葉蟲茶丙酮提取總固體約25.0mg,共6份,分別每3份各精密加入10mL和12mL的對照品溶液B,用80%乙醇溶解,于25mL量瓶中稀釋至刻度,搖勻。精密量取0.5mL供試品溶液B,按“2.3”項下方法操作,以供試品空白為參比,在620nm波長處測定吸光度,計算丙酮提取物中總糖的回收率,結(jié)果見表2。2.7測定總糖含量2.7.1蟲茶湯提總固體含量按“2.2.1”法制備濾過的提取液,精密移取40mL于90℃恒重的坩堝中,水浴揮干溶劑后恒重,精密稱定并計算蟲茶水提總固體含量為(31.1±0.3)%(n=3)。分別精密量取1mL供試品溶液A,按“2.3”項下方法操作,以供試品空白為參比,在620nm波長處測定吸光度,計算三葉蟲茶水溶性總糖的含量:按水提取總固體計算的總糖含量為30.6%,按三葉蟲茶計算的總糖含量為9.51%,RSD為2.0%(n=3)。2.7.2總糖含量的測定精密量取0.5mL供試品溶液B,按“2.3”項下方法操作,以供試品空白為參比,在620nm波長處測定吸光度,計算丙酮提取總固體中總糖的含量為13.4%,RSD為1.9%(n=3)。結(jié)果表明水提總固體中總糖含量是丙酮總固體含量的2.3倍,而且丙酮提取的總糖只占水溶性總糖的1.7%。3水溶液中總糖含量的測定—討論三葉蟲茶水溶性總糖用蒽酮-硫酸比色法測定,當(dāng)使用普通分光光度法(即用試劑空白)測定時,因未能消除試樣基體有色的干擾,其吸收曲線中峰型不明顯,而改用差示光譜法(ΔA法)(即用供試品空白)消除試樣基體有色的干擾后,其峰型明顯,且最大吸收峰在620nm附近,基本上與對照品的一致。丙酮提取物不能用水溶解,用80%乙醇溶解制備供試品溶液。但是繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時,與水相比,80%乙醇作溶劑溶解葡萄糖,后者的靈敏度明顯高于前者,因此測定水溶性總糖和丙酮提取的總糖時,使用了兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線進行含量測定。這也為非水提取的樣品測定總糖含量提供了一種可行的方法,且靈敏度更高。該法測定三葉蟲茶水溶性總糖和丙酮提取物中的總糖含量,結(jié)果可靠,重復(fù)性好。本實驗研究表明三葉蟲茶的水提取物和丙酮提