東亞鉗蝎毒素純化組分對大鼠皮膚痛覺的影響

東亞鉗蝎毒素純化組分對大鼠皮膚痛覺的影響

1材料和方法1.1動物、材料和儀器wistar大鼠，h，240-300g，由中國科學院上海腦研究所實驗動物室提供。東亞鉗子的粗毒從蘇州郊區(qū)的個人蝎子育種廠購買，nalophone，購自西格瑪。rty-3大鼠輻射熱測量系統(tǒng)、西安鳳蘭電子儀器廠、smup生物信號微型處理系統(tǒng)、上海醫(yī)科大學生物科學研究部。1.2蛋白峰的分離和純化東亞鉗蝎粗毒由電刺激法采集,首先經(jīng)SephadexG-25分子篩柱,取峰1,再經(jīng)SephadexG-50凝膠柱進行分離得4個蛋白吸收峰.峰1-1,1-2主要為分子量在9000以上的大分子物質(zhì),根據(jù)多肽分子表面電荷性質(zhì)的不同,用DEAESephadexA-50陰離子交換凝膠柱將峰3分離得5個蛋白吸收峰,對樣品1-3-2經(jīng)HPLC圖譜鑒定可得1-3-2-1和1-3-2-2兩個組分,再用RP-HPLC方法將其反復純化,經(jīng)SDS-PAG電泳的鑒定,得BmKAS-1.1.3手術方法2.4大鼠在戊巴比妥鈉(40mg·kg-1,ip)麻醉下手術,作頭頸背部正中皮膚切口,暴露寰枕膜,在枕骨大孔處挑破寰枕膜插入PE10管,插入時注意勿刺傷脊髓,自枕骨大孔插入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔7.5cm左右(根據(jù)動物體重調(diào)整插入深度),管尖抵達脊髓腰膨大處.術后2d選四肢無運動異常的動物進行試驗,試驗畢進行尸檢,凡管尖未達到規(guī)定部位者其結果摒棄不用.1.4基礎痛閾的測定先將大鼠放在輻射熱測痛儀實驗臺上,安靜5min后進行實驗,以縮腿潛伏期(PWL)作為測痛指標.調(diào)節(jié)測痛儀光輻射熱強度,使基礎PWL在4-6s.給藥前每隔3min測痛1次,取3次平均值作為基礎痛閾,鞘內(nèi)給藥后每隔3min測痛1次,以所測PWL值與基礎痛閾的變化百分數(shù)來表示痛閾變化,以PWL升高150%為上限以防灼傷鼠足跖.鞘內(nèi)給藥時,每次注射總體積15μL(藥液5μL在前,生理鹽水10μL在后),對照注射等體積的生理鹽水,納洛酮在BmK給藥前10min給予.1.5sm回復突變反應amk用氨基甲酸乙酯(1.1g·kg-1,ip)麻醉大鼠俯臥在自動調(diào)節(jié)溫度的恒溫平臺上,用一對不銹鋼針插入單側后肢第二,三腳趾皮下,施強電流刺激(40V,4ms,0.5Hz,每組連續(xù)15次,兩組間隔3min)作為傷害性刺激.一對針電極插入同側下肢半膜半腱肌作為記錄電極.誘發(fā)的反應由A和C兩個成分組成.經(jīng)前級放大器和VC-11型示波器,輸入到SMUP微機處理系統(tǒng),根據(jù)設定的“窗口”和信號電平,只選擇C反應作面積積分.待誘發(fā)的肌電反應穩(wěn)定后,在緊靠兩刺激電極尖端之間的跖部sc注射藥物,所有注射均在同一部位,每次注射10μL,對照注入等體積的生理鹽水,納洛酮在BmK給藥前10min給予.1.62結果2.1納洛酮在bmkf-10.0.0.3.每只大鼠ithBmKAS-11.2g,給藥后3min痛閾已明顯升高,達140%,至9min時痛閾提高至150%以上,持續(xù)至18min迅速下降.每只以0.6μgith后3min痛閾提高,在70%-100%之間持續(xù)達15min.以0.1μgBmKAS-1同樣給藥則未見痛閾提高(圖1).用同樣的方法進行實驗,未觀察到納洛酮對BmKAS-1的鎮(zhèn)痛有翻轉(zhuǎn)作用.每只給予BmKF-1-30.01-0.003μgith后,可見動物明顯的異常反應,如呼吸加快,后肢痙攣,頻繁排尿,反應遲鈍等.在0.001μg時上述毒性反應基本消失,但亦未見提高痛閾的作用.2.2納洛酮對bmkf-1,bmks-2,bmkf-1的抑制作用以電刺激大鼠后肢趾部誘發(fā)的半膜半腱肌C成分作為痛閾反應指標,在刺激電極間每只scBmKF-1-380μg對C成分最大抑制率為70%,40μg時最大抑制率為50%(圖2).BmKF-1-3-260,30和15μg的最大抑制率分別為62%,53%和26%,抑制作用維持約20min(圖3).BmKAS-120,10和5μg最大抑制率分別為71%,50%,28%(圖4).納洛酮對BmKF-1-3,BmKF-1-3-2,BmKAS-1的外周鎮(zhèn)痛均無翻轉(zhuǎn)作用.3亞氏原螯蝦思想神經(jīng)再生時體外熱痛行為的反應本研究觀察到的第一個現(xiàn)象是BmKAS-1sc和ith后及BmKF-1-3-2和BmKF-1-3sc后,對外周痛有抑制作用,并且這種抑制作用可能既涉及到中樞機理,也涉及到外周機理.本研究觀察到的第二個現(xiàn)象是東亞蝎毒多肽的鎮(zhèn)痛作用不通過阿片系統(tǒng)產(chǎn)生,作者的實驗結果表明,無論是外周皮膚感受野給藥還是脊髓蛛網(wǎng)膜ith給藥,其鎮(zhèn)痛作用均不被納洛酮翻轉(zhuǎn),這說明該類毒素活性多肽的鎮(zhèn)痛機理可能有別于阿片肽類物質(zhì).作者先前的工作表明東亞鉗蝎毒素幾種初級純化組分有鎮(zhèn)痛作用.但同時也看到局部感受野sc給藥出現(xiàn)較明顯的紅腫現(xiàn)象,這說明初級純化組分中含有致炎物質(zhì),那么隨著純化程度的提高,鎮(zhèn)痛作用是否隨之增強?致炎和毒性作用隨之減弱?這是本工作要回答的第三個問題.作者觀察到在皮膚局部感受野強電流刺激誘發(fā)肌電C反應實驗中,BmKAS-1抑制50%C成分的劑量比BmKF-1-3,BmKF-1-3-2降低了3-4倍,但BmKF-1-3和BmKF-1-3-2相差不大.而在脊髓給藥足跖輻射熱痛閾實驗中,BmKAS-1有明顯的提高痛閾的作用,BmKF-1-3無作用,看來蝎毒純化程度和鎮(zhèn)痛強度之間關系并非線性正相關的關系.從本實驗BmKF-1-3在外周給藥和脊髓給藥不同的作用特點來看,東亞鉗蝎毒多肽的鎮(zhèn)痛作用機理可能是比較復雜的,對不同類型的鎮(zhèn)痛作用不同.既然蝎毒多肽的鎮(zhèn)痛作用與阿片受體無關,那么其通過何種機理起作用?這是在學術和應用開發(fā)研究中均有重要意義的疑題.目前作者正在進行東亞鉗蝎毒素多肽對背根神經(jīng)節(jié)細胞TTX-R和TTX-S鈉通道作用和NMDA受體通道作用的研究,以期更深入地了解東亞鉗蝎毒素多肽的作用機理.結果以C反應面積抑制百分比表示,組間差異的比較用t檢驗.蝎神經(jīng)毒素的多個純化組分作為工具藥被應用在神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導機理的研究中.自70年代Miranda等首次成功地從北非3種蝎毒中純化并鑒定了11個神經(jīng)毒素多肽以來,距今20多年間,國際上已陸續(xù)報道了在近30個不同種屬蝎毒中100多個神經(jīng)毒素多肽成分.與此相比,對已分離的多肽其功能的研究還有太多的空區(qū).本研究組對國產(chǎn)東亞鉗蝎(學名馬氏鉗蝎,ButhusmartensiKarsch,BmK)毒素的純化,結構解析和對受體的作用進行了系統(tǒng)的研究.BmKAS-1是新近篩分的經(jīng)HPLC純化獲得的一個多肽,BmKAS-1完整的序列結構已被確定,由66個殘基組成,經(jīng)藥理實驗觀察,BmKAS類多肽可增強標記的Ryanodine與兔骨骼肌