食物過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)展

食物過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)展

食物過(guò)敏是人類(lèi)健康的一個(gè)重要問(wèn)題，近年來(lái)在工業(yè)世界引起了越來(lái)越大的關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)世界范圍內(nèi)大約有2%-3%的成年人,5%-8%的兒童對(duì)一種或多種食物過(guò)敏。食物過(guò)敏是口服含有致敏原的食物后,人體免疫系統(tǒng)對(duì)該致敏原的有害的反應(yīng)。由食物過(guò)敏引起的急性病癥主要有嘴、口、舌、眼睛、皮膚的干燥和腫脹;吞咽困難;鼻腔充血、流鼻涕;嘔吐;腹痛或胃痙攣;頭暈;暈厥;甚至引起過(guò)敏性休克而導(dǎo)致死亡。由食物致敏原也可誘導(dǎo)或加重哮喘、特異性皮炎、過(guò)敏性鼻炎等。1cd4+t細(xì)胞激活食品致敏原絕大部分為蛋白質(zhì),由其引起的過(guò)敏反應(yīng)可按不同抗體的介導(dǎo)分為三種類(lèi)型:1)由抗體蛋白IgE介導(dǎo)型;2)由非抗體蛋白IgE介導(dǎo)型;3)可由抗體蛋白IgE或非抗體蛋白IgE介導(dǎo)型。絕大多數(shù)的食物過(guò)敏反應(yīng)屬于IgE介導(dǎo)型。在食品中的致敏原經(jīng)消化以肽的形式進(jìn)入體液后,這種致敏蛋白經(jīng)II型主要組織相容性復(fù)合體(MHCII)提呈給T細(xì)胞,并結(jié)合于T細(xì)胞的表面。CD4+T細(xì)胞可由T細(xì)胞受體分子(CD4分子)識(shí)別致敏原與MHCII的結(jié)合體而被激活,形成了致敏原特異性CD4+T細(xì)胞,而致敏源特異性CD4+T細(xì)胞可產(chǎn)生Th2型細(xì)胞活性素。這其中白介素-4(IL-4)為主要的細(xì)胞活性素,白介素-4可使得經(jīng)抗原刺激后的B細(xì)胞生成大量的IgE。IgE和IgE高度親和受體(FcεRI)結(jié)合,并結(jié)合于組織中的肥大細(xì)胞(mastcell)和血液中的嗜堿性粒細(xì)胞的表面。肥大細(xì)胞在誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的過(guò)程中起著主要的作用。多價(jià)抗原約束IgE與FcεRI聚集而成的結(jié)合物,刺激肥大細(xì)胞,從而導(dǎo)致肥大細(xì)胞釋放顆粒和炎性介質(zhì),包括組胺、前列腺素和白三烯(LTC4,LTD4,LTE4)、蛋白多糖(肝磷脂和軟骨素)以及蛋白酶(類(lèi)以蛋白酶和糜蛋白酶)等生物活性介質(zhì),作用于效應(yīng)組織和器官,引起局部或全身的變態(tài)反應(yīng)。當(dāng)嗜堿性粒細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞時(shí),主要是通過(guò)釋放毒性顆粒蛋白和脂類(lèi)介質(zhì)造成組織損傷。2食物中過(guò)敏蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征。3醇溶種子儲(chǔ)存蛋白、ige導(dǎo)向過(guò)敏反應(yīng)在醇溶谷蛋白中,可以起過(guò)敏反應(yīng)的蛋白主要有四種:醇溶種子儲(chǔ)存蛋白(prolaminseedstorageprotein);非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(non-specificlipidtransferproteins,nsLTPs);谷物的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制因子(α-amylase/trypsininhibitor);2S清蛋白(2Salbumins)。以上四種蛋白均為富含胱氨酸的低分子量蛋白質(zhì),其三維結(jié)構(gòu)則呈現(xiàn)多α-螺旋結(jié)構(gòu),且比較穩(wěn)定,與其他蛋白質(zhì)相比較,受熱和蛋白酶的影響較小。谷物,例如小麥,其醇溶種子儲(chǔ)存蛋白大約占總蛋白的50%,醇溶種子儲(chǔ)存蛋白與IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)有關(guān),如小麥中的醇溶種子儲(chǔ)存蛋白誘發(fā)的遺傳過(guò)敏性皮炎則屬于由IgE介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)。已報(bào)道的醇溶種子儲(chǔ)存蛋白中的過(guò)敏源有ω-麥醇溶蛋白(ω-gliadin),麥谷蛋白(glutenin)等。非特異脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(nsLTPs)在植物中的主要作用是協(xié)助細(xì)胞間的磷脂傳遞,近些年來(lái)也有報(bào)道證實(shí)了其在植物對(duì)真菌和細(xì)菌的防御方面起著主要作用。研究者已經(jīng)鑒定了來(lái)自水果、蔬菜和堅(jiān)果類(lèi)的nsLTPs過(guò)敏原。nsLTPs對(duì)消化酶表現(xiàn)出了很高的抗性,同時(shí)特異的LTP-IgE的出現(xiàn)被認(rèn)為是可能引起較嚴(yán)重的過(guò)敏癥狀的標(biāo)志。谷物中的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制因子可抑制淀粉酶/蛋白酶的活力,既可抑制了昆蟲(chóng)對(duì)植物淀粉和蛋白質(zhì)的消化,由此起到了抵御昆蟲(chóng)侵害的作用。這些α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制因子大約包含120-160個(gè)氨基酸,三級(jí)結(jié)構(gòu)中大約含有4個(gè)二硫鍵,一般以單體,二聚體或者四聚體的形式存在。谷物中的α-2S清蛋白是雙子葉植物(如巴西果、胡桃、芝麻、芥菜)中的一種儲(chǔ)存蛋白。典型的2S清蛋白,如巴西堅(jiān)果的2S清蛋白,含有兩條分子量約為4kDa和9kDa的多聚肽鏈,鏈條肽鏈之間由4個(gè)二硫鍵相連接?，F(xiàn)在已鑒定的具有致敏性的α-2S清蛋白有來(lái)自花生的Arah2,Arah6;來(lái)自黃芥菜的Sina1等。Arah2,Arah6的分子量分別為17和15kDa;Arah2有兩個(gè)同工型(Arah2和Arah2.02),二者的差異在于N-端的殘基,Arah2為L(zhǎng)QGDRRC而Arah2.02則是GDRRC。Arah2被認(rèn)定是90%的花生過(guò)敏人群的主要過(guò)敏原。Arah6則被認(rèn)為是可誘發(fā)38%-43%的花生過(guò)敏人群發(fā)生過(guò)敏的過(guò)敏原。其與Arah2的氨基酸序列有高度同源性,但因其含有5個(gè)二硫鍵,不同于含有4個(gè)二硫鍵的Arah2。3.1引發(fā)性蛋白質(zhì)圖像檢測(cè)Cupin是一組中心區(qū)域由β-折疊構(gòu)成的蛋白,可以根據(jù)蛋白中含有的cupin結(jié)構(gòu)區(qū)域的數(shù)目將其分為不同的cupin亞群。如源于柿子椒和橙子的萌芽素(germins)為單cupin亞群。而具有兩個(gè)cupin結(jié)構(gòu)域的蛋白(Bicupins)主要出現(xiàn)在高等植物種子儲(chǔ)藏蛋白中,它包括7/8S和11S種子儲(chǔ)藏球蛋白,且7/8S和11S球蛋白有35%～45%的序列相似性。豌豆球蛋白(vicilin)為三聚體的7/8S球蛋白,分子量為150-190kDa;豆球蛋白為11S球蛋白六聚體。Cupin蛋白的進(jìn)化可以追溯至古細(xì)菌、細(xì)菌到真核生物,其特殊的結(jié)構(gòu)可以保證蛋白質(zhì)的存活并為蛋白質(zhì)發(fā)揮其功能提供一個(gè)穩(wěn)定的支架。Cupin的三級(jí)結(jié)構(gòu)具有良好的耐熱性,Cupin蛋白家族中的致敏蛋白主要來(lái)自豆類(lèi)、堅(jiān)果、芝麻等。3.2在分子身份證上的相似性Betv1相關(guān)蛋白廣泛存在于維管植物中,首先在這一族群中被鑒定出的過(guò)敏原為樺樹(shù)花粉蛋白,Betv1,其是90%樺樹(shù)花粉過(guò)敏癥的致敏原。Betv1相關(guān)蛋白族群是由154-160個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,且在蛋白序列上有著高度相似性。X射線法分析同屬于Betv1相關(guān)蛋白族群的來(lái)自于櫻桃的Praav1,源于芹菜的Apig1和胡蘿卜的Dauc1,結(jié)果顯示,他們都具有相似的結(jié)構(gòu),包括七股反向的β-折疊,與C末端的一長(zhǎng)螺旋相連接,同時(shí)有兩個(gè)短的螺旋結(jié)構(gòu)鏈接于β-折疊中的β1和β2之間,由此形成了一個(gè)Y形的疏水結(jié)構(gòu),這一疏水結(jié)構(gòu)主要用于鏈接植物類(lèi)固醇。一般來(lái)說(shuō),Betv1相關(guān)蛋白受pH的影響較大,但對(duì)熱有著良好的耐受能力。由Betv1相關(guān)蛋白引起的過(guò)敏反應(yīng)一般癥狀較溫和,而由含有Betv1相關(guān)蛋白的食品所造成的過(guò)敏反應(yīng)常常與花粉引起的過(guò)敏反應(yīng)相似,而如來(lái)自大豆的Glym4,可引起嚴(yán)重過(guò)敏癥狀。3.3致敏肌球蛋白蝦、蟹等甲殼類(lèi)食品也可引發(fā)食物性過(guò)敏反應(yīng),其中主要的致敏原為肌肉內(nèi)的原肌球蛋白。原肌球蛋白廣泛存在于真核生物中,包含多個(gè)亞種,且結(jié)構(gòu)上具有高度的保守性。其結(jié)構(gòu)為由兩條平行的α-螺旋結(jié)構(gòu)形成的螺旋卷曲鏈,每條鏈上的每一螺旋卷曲上均含有七個(gè)肌動(dòng)蛋白(actin)結(jié)合點(diǎn)。在橫紋肌細(xì)胞中,原肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合物與肌鈣蛋白之間相互作用,由此可調(diào)節(jié)肌肉收縮。迄今為止發(fā)現(xiàn)的致敏肌球蛋白均為非哺乳動(dòng)物來(lái)源,且都具有較高的與IgE結(jié)合活性。由于原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,即使在受到熱和酶的作用后,依然可保留與IgE結(jié)合的能力。3.4阿斯塔納的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)小清蛋白為肌肉中的一種鈣結(jié)合蛋白,分子量約為12kDa,具有EF手型結(jié)構(gòu),主要參與肌肉的收縮。EF手型結(jié)構(gòu)為保守的鈣離子結(jié)合區(qū)域,由12個(gè)氨基酸殘基形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu),同時(shí)在這一環(huán)的兩側(cè)分別連有由12個(gè)氨基酸形成的α-螺旋結(jié)構(gòu),由此構(gòu)成了螺旋-環(huán)-螺旋的結(jié)構(gòu)。迄今為止,發(fā)現(xiàn)的具有致敏性的小清蛋白主要來(lái)源于魚(yú)類(lèi),而更高級(jí)的哺乳動(dòng)物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有致敏性的小清蛋白。3.5致敏干酪蛋白酪蛋白是哺乳動(dòng)物的乳汁中的重要蛋白質(zhì),其中αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和β-酪蛋白通過(guò)肽鏈上的磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸殘基綁定鈣離子,這些酪蛋白鈣離子的結(jié)合體在κ-酪蛋白作用下形成比較穩(wěn)定的微簇結(jié)構(gòu)。致敏酪蛋白一般分子量在10-70kDa之間,在生物體內(nèi)都具有一定的生物功能,如水解蛋白質(zhì)或多糖、結(jié)合其他物質(zhì)、運(yùn)輸、儲(chǔ)備等。一般來(lái)說(shuō)在三維結(jié)構(gòu)上如果酪蛋白與某種致敏蛋白相似,則這種蛋白有可能具有與IgE發(fā)生交叉反應(yīng)的可能。但在致敏蛋白上也可能存在著某些關(guān)鍵的與抗體識(shí)別有關(guān)的氨基酸殘基,如果這些氨基酸被改變則會(huì)影響抗體與致敏蛋白的結(jié)合活性。4乳蛋白的提取過(guò)敏蛋白的提取是過(guò)敏蛋白檢測(cè)前的主要處理步驟。動(dòng)物食品中的過(guò)敏蛋白質(zhì)提取相對(duì)比較簡(jiǎn)單,一般情況下使用緩沖溶液對(duì)原料進(jìn)行浸提即可得到含有過(guò)敏蛋白的粗提物。例如Langeland等體積的生理鹽水對(duì)雞蛋蛋白浸提4小時(shí),然后離心取上清,得到的粗提物可進(jìn)行臨床或免疫學(xué)研究。與此相類(lèi)似的是利用PBS溶液進(jìn)行提取雞蛋蛋白中的過(guò)敏物質(zhì)。在提取之后經(jīng)透析脫鹽和冷凍干燥得過(guò)敏蛋白的提取物。對(duì)于牛奶中的過(guò)敏蛋白的提取方法相對(duì)復(fù)雜,原因是酪蛋白和乳清蛋白只能自脫脂乳中酸沉獲得。Bleumink和Young在1968年利用1MHCl將乳溶液調(diào)至pH4.65獲得沉淀。將沉淀分離后再用1MNH4OH將pH值調(diào)至7,將沉淀再溶解。將此過(guò)程重復(fù)2次,經(jīng)拖延后冷凍干燥,由此方法可提取酪蛋白致敏物。而乳清致敏蛋白則可由三次酸沉和再結(jié)晶獲得。植物食品中致敏蛋白的提取方法則相對(duì)比較復(fù)雜,因?yàn)橹参镏械囊恍┓堑鞍壮煞挚蓪?dǎo)致致敏蛋白的失活。Bjorksten等人利用在含有2mM乙二胺四乙酸納(EDTA)、10mM二乙基二硫代氨基甲酸酯(DIECA)及3mM疊氮化鈉(NaN3)的10mM磷酸鉀緩沖溶液(pH7.0),并在其中添加了2%聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)形成懸濁液,再利用懸濁液對(duì)果肉進(jìn)行均質(zhì)。懸濁液中的PVPP、EDTA及DIECA可以抑制蛋白質(zhì)與酚類(lèi)化合物之間的反應(yīng),NaN3可以抑制微生物的滋生。經(jīng)均質(zhì)后40000g離心30min,后4℃條件下透析脫鹽20h。為了避免致敏能力的丟失,提取物應(yīng)放置于-20℃條件下。此方法可以用于廣泛植物中致敏蛋白的提取。谷物作為人類(lèi)的主要食物,對(duì)于它的過(guò)敏物的提取及檢測(cè)有著重要的意義。因谷物中的過(guò)敏成分多樣、復(fù)雜,谷物中的過(guò)敏蛋白的提取方法則相對(duì)比較復(fù)雜。谷物中的清蛋白和球蛋白溶于中性溶液中,這兩種蛋白的提取相對(duì)比較容易,利用100mM碳酸氫氨對(duì)小麥粉進(jìn)行震蕩過(guò)夜即可提取。而對(duì)于谷蛋白和谷醇溶蛋白則溶于酸性溶液中。目的提取物不同,提取工藝則有差異。5細(xì)胞免疫藥物vitro法食物過(guò)敏可引起個(gè)體消費(fèi)者的健康問(wèn)題,甚至?xí)＜吧?因此標(biāo)識(shí)食物過(guò)敏原在一些發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)立法,而在發(fā)展中國(guó)家,也將趨于完善這一方面的法律、法規(guī)。無(wú)論對(duì)于要提供準(zhǔn)確的過(guò)敏原標(biāo)簽的生產(chǎn)者,還是對(duì)于保護(hù)消費(fèi)者的健康與安全的國(guó)家監(jiān)管部門(mén),檢測(cè)食物致敏蛋白的方法都是非常重要的。對(duì)過(guò)敏蛋白的檢測(cè)方法可分為體內(nèi)(invivo)法和體外(invitro)法。體內(nèi)法主要指口服或皮刺試驗(yàn)、動(dòng)物模型試驗(yàn)及雙盲安慰劑對(duì)照激發(fā)試驗(yàn)(double-blindplacebocontrolledfoodchallenges,DBPCFC)等,但由于這些試驗(yàn)備受社會(huì)倫理道德的質(zhì)疑,應(yīng)用范圍受到了限制。體外法則被更加廣泛的應(yīng)用于檢測(cè)過(guò)敏蛋白。體外方法則可分為基于蛋白的檢測(cè)方法(protein-basemethod)和基于DNA的檢測(cè)方法(DNA-basemethod)。基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)多為利用免疫化學(xué)的檢測(cè)方法,如酶聯(lián)免疫法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)、酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)(enzymeallergosorbenttest,EAST)放射過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)(radio-allergosorbenttest,RAST),火箭免疫電泳(rockedimmuno-electrophoresis,RIE),斑點(diǎn)免疫印跡法(Dotimmunoblotting)等。而基于DNA的檢測(cè)方法則主要為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和PCR-ELISA法。5.1elisa檢測(cè)酶聯(lián)免疫法是檢測(cè)食物過(guò)敏原的主要方法,其準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度均較高。原理是利用酶標(biāo)記的抗體與某種特異的蛋白或抗原結(jié)合,同時(shí)伴隨有顏色反應(yīng),測(cè)定顏色反應(yīng)的有無(wú)或程度來(lái)進(jìn)行定性定量。而檢測(cè)食品的致敏原時(shí)常用的有競(jìng)爭(zhēng)ELISA(competitiveELISA),和夾心ELISA(sandwichELISA)方法。適用于檢測(cè)小分子量的蛋白質(zhì)(抗原)的競(jìng)爭(zhēng)ELISA是將抗體與被測(cè)樣品同時(shí)與綁定于固定相的酶標(biāo)記抗原混合,如果樣品中沒(méi)有合適的抗原,那么抗體將和固定相中的抗原結(jié)合并發(fā)生顏色反應(yīng)。如果樣品中含有抗原則會(huì)抑制抗體與酶標(biāo)記抗原的結(jié)合,且樣品中抗原的濃度于顏色反應(yīng)的程度呈反比。夾心ELISA比競(jìng)爭(zhēng)ELISA應(yīng)用更廣泛,這一方法首先是使結(jié)合于固相載體上的抗體與樣品中的蛋白(抗原)結(jié)合,形成抗體抗原復(fù)合物,然后再加入酶標(biāo)記的二抗(secondaryantibody),二抗將于抗體抗原復(fù)合物相結(jié)合,發(fā)生顯色反應(yīng),結(jié)合于固相載體上的抗原越多,與二抗的顯色反應(yīng)程度越深,由此實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原(致敏原)的定性及定量檢測(cè)。ELISA電感耦合等離子質(zhì)譜法(ELISA-ICP-MS)是近年來(lái)科研工作者開(kāi)發(fā)的新方法,靈敏度和準(zhǔn)確度更高。這種方法中利用同位素代替了原來(lái)的酶標(biāo)記法,然后再利用質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。酶聯(lián)免疫法技術(shù)較為成熟,應(yīng)用較為廣泛。如夾心ELISA方法被應(yīng)用于檢測(cè)牛乳中的β-乳球蛋白,檢測(cè)限為0.002mg/l,用夾心ELISA方法檢測(cè)杏仁中過(guò)敏物時(shí),檢測(cè)限可達(dá)到1ppm。競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法也可應(yīng)用于牛乳中的β-乳球蛋白的檢測(cè)以及花生蛋白的檢測(cè)等。5.2酶標(biāo)記超編成像檢測(cè)ige抗體的方法這兩種方法與酶聯(lián)免疫法相似,對(duì)特異的IgE抗體與抗原然后進(jìn)行檢測(cè),然后在利用酶或放射性元素,如125I標(biāo)記的抗IgE抗體(anti-IgEantibody)來(lái)檢測(cè)IgE抗體抗原復(fù)合體。這種方法的缺點(diǎn)是由于人血清的個(gè)體差異而難以標(biāo)準(zhǔn)化。酶標(biāo)記過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)與放射過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)這兩種方法主要被用來(lái)做臨床的食物過(guò)敏診斷,可進(jìn)行定性檢測(cè)。放射過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)也被報(bào)道可應(yīng)用于過(guò)敏原的定量檢測(cè)。5.3兩種熱壓下生成的權(quán)利義務(wù)不相關(guān)的問(wèn)題火箭免疫電泳RIE是用含有已知抗體的凝膠,待測(cè)樣品被加入陰極測(cè)的點(diǎn)樣孔,樣品中的抗原在電場(chǎng)的作用下,向陽(yáng)極移動(dòng),并在抗原與抗體比例適當(dāng)?shù)膮^(qū)域沉積,并形成錐形的條帶,這一錐形的條帶形狀酷似火箭,由此得名。錐形條帶的高度與抗原抗體的比例相關(guān),同一凝膠中,條帶的高度則與抗原的量成正比。Holzhauser等利用此種方法對(duì)花生中過(guò)敏蛋白進(jìn)行了定性檢測(cè),檢測(cè)限為30mg/kg?；鸺庖唠娪镜哪z制備和染色過(guò)程較為繁瑣,制約了其在食物過(guò)敏蛋白檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。5.4加入酶標(biāo)記抗體斑點(diǎn)免疫印跡法是相對(duì)比較簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的食物抗原檢測(cè)方法。待測(cè)樣品被噴灑到硝酸纖維膜和PVDF膜上,再加入酶標(biāo)記抗體,如樣品中含有目標(biāo)抗原,則可與抗體結(jié)合并伴隨有顏色反應(yīng),形成斑點(diǎn)。當(dāng)然也可用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記。這種方法多屬于半定量方法,斑點(diǎn)的顏色深淺與抗原的量有關(guān)。2000年,Blais等報(bào)道了利用斑點(diǎn)免疫印跡法檢測(cè)食物中的花生蛋白(含量大約為2.5mg/kg)。5.5提高pcr檢測(cè)的價(jià)值PCR技術(shù)在食品安全方面的應(yīng)用日益增多,如食品中的病原微生物、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)等。PCR技術(shù)對(duì)于食品中的過(guò)敏原檢測(cè)實(shí)際上是一種間接方法,通過(guò)檢測(cè)可編碼過(guò)敏蛋白的基因是否存在,從而