蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾課件

蛋白質(zhì)分子量測(cè)定蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定

蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個(gè)最基本技術(shù),是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題,尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時(shí)顯得更重要。研究一個(gè)新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進(jìn)行分離純化，最終用純品對(duì)其進(jìn)行分析鑒定。如果對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來將會(huì)困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)主要是對(duì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進(jìn)行分析鑒定。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)鑒定的主要參數(shù)蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子,能代表其特征參數(shù)很多.但在普通實(shí)驗(yàn)室能夠進(jìn)行測(cè)定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下幾種。(1)蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定(分子量)(2)蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點(diǎn)）(3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定(一、二級(jí)結(jié)構(gòu)、晶體、肽譜、NC-末端)(4)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定(生物活性、比活、酶促動(dòng)力學(xué))(5)免疫學(xué)鑒定（抗原-抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)）蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾意義確定分子大小從氨基酸組成分析的結(jié)果求得準(zhǔn)確的氨基酸組成驗(yàn)證已測(cè)定的一級(jí)結(jié)構(gòu)是否正確蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾常用測(cè)定分子量的方法SDS凝膠過濾層析質(zhì)譜核磁共振蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾一、SDS－PAGE

測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【基本原理】

聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測(cè)蛋白質(zhì)混合樣品，主要是根據(jù)各蛋白質(zhì)各組分的電泳遷移率的不同。

這種遷移率的不同，就蛋白質(zhì)分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關(guān)。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾當(dāng)電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時(shí)，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，從而可推測(cè)蛋白質(zhì)的分子量。

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾SDS的作用原理

SDS是一種陰離子去污劑，能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其它物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變?cè)械目臻g構(gòu)象。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

蛋白質(zhì)分子一經(jīng)結(jié)合了一定量的SDS陰離子，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有電荷量，從而消除了不同種類蛋白質(zhì)間電荷的差異。

并且由于分子量越大的蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS越多，所帶負(fù)電荷也越多，這就使各蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電荷密度趨于一致。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

同時(shí)，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物形狀也相似，均是長橢圓狀。

因此，在電泳過程中，遷移率僅取決于蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的大小，也可以說是取決于蛋白質(zhì)分子量的大小，而與蛋白質(zhì)原來所帶電荷量無關(guān)。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾當(dāng)SDS的總量為蛋白量的3～10倍且SDS單位濃度大于1mol/L時(shí)，這兩者的結(jié)合是定量的，大約每克蛋白質(zhì)可結(jié)合1.4克SDS。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

組成

該電泳系統(tǒng)由兩層不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠組成上層膠:濃縮膠(stackingorconcentrationgel)

濃度2-5%，緩沖液pH值為6.8

下層膠：分離膠(seperationorresolvinggel)

濃度5-20%，緩沖液pH值為8.3蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾特點(diǎn)

具有很高的分辨力，這是因?yàn)樗哂幸韵氯N效應(yīng)：▼樣品濃縮效應(yīng)

A.分離膠的阻力（孔徑?。瑵饪s作用

B.緩沖液離子成分的不同[（甘氨酸離子（慢）氯離子（快）]，壓縮作用

C.濃縮膠與分離膠之間pH值差（分離膠pH高，調(diào)節(jié)慢離子的遷移率）

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

▼分子篩效應(yīng)

大分子運(yùn)動(dòng)慢，小分子運(yùn)動(dòng)快

▼電荷效應(yīng)

帶電荷多的運(yùn)動(dòng)快，帶電荷少的運(yùn)動(dòng)慢蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

【器材】

電泳儀、

垂直板電泳槽、

進(jìn)樣器、

乳頭吸管、

50ml小燒杯

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【試劑】

1．標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾30%丙烯酰胺溶液

丙烯酰胺29.2g，

甲叉雙丙烯酰胺0.8g，

加水至100ml，棕色瓶4℃保存。1.5mol/LTris-Hcl分離膠緩沖液pH8.8（4x）

取18.15gTris，用1MHCl調(diào)pH至8.8，加水

至100ml，4℃保存0.5mol/LTris-HCl濃縮膠緩沖液pH6.8（4x）

取5.98gTris，用1NHCl調(diào)至pH6.8，加水至

100ml，4℃保存。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾5.電極緩沖液（pH8.3）

取14.49g甘氨酸，3.02gTris，加100ml

10%SDS，加水至1升，4℃保存。

6.10%SDS

取10gSDS，加水至100ml，完全溶解后室溫保存。

7.10%過硫酸銨溶液（AP）

臨用前現(xiàn)配。

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾8．染色液（0.25%R-250、50%甲醇、7%乙酸）

考馬斯亮藍(lán)R-2502.5g、

甲醇（可用無水乙醇代替）

500ml、70ml冰乙酸，

溶解后補(bǔ)足水至總體積1000ml。

9．脫色液（30%甲醇、7%乙酸）

甲醇（可用無水乙醇代替）

300ml，冰乙酸70ml，

補(bǔ)足水至1000ml。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾10．樣品緩沖液（2x）

H2O2.4ml，濃縮膠緩沖液1.0ml、甘油0.8ml、10%

SDS3.2ml，b-硫基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴

酚蘭0.2ml。

11．TEMED（四甲基乙二胺）

Tetramethylethylenediamine

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾分離膠和濃縮膠的配制蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾將分離膠混勻后立即灌注于玻板間隙中，上層小心覆蓋一層正丁醇。將膠板垂直放于室溫下，待分離膠聚合完全后，傾去正丁醇并用濾紙吸干。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾灌膠時(shí)要注意催化劑不能加多了，加完催化劑要充分混勻，且立即灌膠，灌膠時(shí)要保持小燒杯搖動(dòng)，防止燒杯內(nèi)的膠聚合。灌膠動(dòng)作要快，吸一滿管的凝膠后，立即沿膠板的一角灌入，而且要防止氣泡的產(chǎn)生。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾樣品預(yù)處理

取樣品液與等體積樣品緩沖液混合，100℃加熱1～2分鐘。

待濃縮膠聚合完全后，小心移出梳子，然后將膠板固定于電泳裝置上，上下槽各加入電極緩沖液。

加樣

用微量進(jìn)樣器加樣。每個(gè)樣品孔加入20ul樣品。同時(shí)加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【電泳】

在100V的電壓下電泳，當(dāng)樣品全部進(jìn)入分離膠時(shí)，加大電壓至100V，當(dāng)溴酚藍(lán)達(dá)到膠底部，關(guān)閉電源。

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【染色】

從電泳裝置上卸下玻板，小心橇開玻板取出凝膠，放入染色液中染色30min。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【脫色】

移出凝膠放入脫色液中脫色至本底無色為止。

蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【觀察電泳結(jié)果】根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品，大致推測(cè)蛋白質(zhì)的分子量。

用直尺分別量出標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、待測(cè)蛋白質(zhì)區(qū)帶中心以及溴酚藍(lán)前沿距分離膠頂端的距離，按下式計(jì)算相對(duì)遷移率（R）：

相對(duì)遷移率=樣品遷移距離（cm）/指示劑遷移距離（cm）

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Mr的常用對(duì)數(shù)（lgMr）對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對(duì)分子量的常用對(duì)數(shù)，再換算出其相對(duì)分子量。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾二、根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定分子量蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾二、凝膠過濾法凝膠過濾法分離蛋白質(zhì)的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠具有特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對(duì)數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對(duì)它們的分子量的對(duì)數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行凝膠層析，根據(jù)其所用的洗脫體積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以求出此未知蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的分子量。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾層析法裝置蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

優(yōu)點(diǎn)

分離條件溫和回收率高重復(fù)性好設(shè)備簡單

缺點(diǎn)

對(duì)樣品的稀釋大流速慢操作費(fèi)時(shí)蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾三、質(zhì)譜法【原理】質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進(jìn)行分離的裝置。離子電離后經(jīng)過加速進(jìn)入磁場(chǎng)中。其動(dòng)能與加速電壓及電荷Z有關(guān)。Z：電荷數(shù)

ZeU=mv2/2e：電荷(e=1.60x10-19C)U：加速電壓m：離子的質(zhì)量v：離子被加速后的運(yùn)動(dòng)速度蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾具有速度v的帶電離子進(jìn)入質(zhì)譜儀的電磁場(chǎng)中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終實(shí)現(xiàn)各種離子按m/z進(jìn)行分離。根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動(dòng)態(tài)和靜態(tài)儀器兩大類，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場(chǎng)，按空間位置來區(qū)別m/z不同的離子。動(dòng)態(tài)儀器采用變化的電磁場(chǎng)，按時(shí)間不同來區(qū)分m/z不同的離子。分離生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動(dòng)態(tài)質(zhì)譜儀?；驹硎巧锎蠓肿釉诤芨叩碾妶?chǎng)下電離。樣品溶液以很低的流速，在高的電場(chǎng)下使生物分子從毛細(xì)管中流出來。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾【方法】樣品溶液以很低的流速(1-20μl/分鐘)從毛細(xì)管中流出來。在毛細(xì)管的柱頭上施加一個(gè)高電壓(1-5kv)，使柱頭液體霧化成很細(xì)的帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷密度增大。直到產(chǎn)生的庫侖斥力與液滴表面張力的雷利極限值相等時(shí)，液滴就會(huì)發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又會(huì)形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴變得非常小，它的表面的電荷密度變得非常大，形成很強(qiáng)的電場(chǎng)，并從液滴中解離出帶多電荷的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以正離子或負(fù)離子譜上會(huì)觀察到譜峰。生物大分子在ESI譜上往往是一組帶不同的電荷的分子離子峰。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾核磁共振波譜(nuclearmagneticresonancespectroscopy,NMR).是將具有磁矩的核放入磁場(chǎng)后，用適宜的頻率的電磁波照射，它們就會(huì)吸收能量，發(fā)生原子核能級(jí)的躍遷，同時(shí)產(chǎn)生核磁共振信號(hào)，得到核磁共振波譜。在有機(jī)化合物中，經(jīng)常用于1H和13C核的共振吸收波譜。在生物學(xué)方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分子量。到目前為止，采用1H2D-NMR（二維NMR）能解決的最大蛋白質(zhì)分子量在10000Da左右。如果采用雜核多維NMR技術(shù)，能解決的最大蛋白質(zhì)分子量大在25000Da左右。四、核磁共振波譜蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾方法機(jī)理分子量計(jì)算關(guān)鍵技術(shù)特點(diǎn)電泳分子表面電荷電泳條帶(mR)SDS包裹單鏈分子層析分子質(zhì)量層析峰的位置介質(zhì)交聯(lián)度球形分子質(zhì)譜質(zhì)荷比質(zhì)譜峰直接標(biāo)識(shí)樣品質(zhì)子化整體分子核磁核磁共振波譜核磁譜線計(jì)算磁場(chǎng)能量整體分子幾種測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的方法比較蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾概念

從廣義上說：凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，都可以稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。包括兩個(gè)方面：（1）側(cè)鏈基團(tuán)的改變；(2）主鏈結(jié)構(gòu)的改變，前者屬于化學(xué)修飾的范疇，而后者則屬于基因重組和定點(diǎn)突變的方法。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的意義改變蛋白質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及活性改變蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾化學(xué)修飾的原理影響蛋白質(zhì)化學(xué)修飾反應(yīng)進(jìn)程的因素有：1蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性（親核性）1.1基團(tuán)之間的氫鍵及靜電作用1.2基團(tuán)之間的空間位阻2修飾劑的反應(yīng)性2.1選擇吸附2.2靜電相互作用2.3位阻因素蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾化學(xué)修飾的方法學(xué)1試劑的選擇

水解穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)，反應(yīng)類型以及專一性；修飾劑的大小；連接鍵的穩(wěn)定性、毒性和抗原性；修飾后是否需要進(jìn)一步的分離；是否適于建立快速、方便的分析方法；是否能夠簡便經(jīng)濟(jì)的合成或購買蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾反應(yīng)條件的選擇考慮因素包括pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)介質(zhì)以及緩沖液組成允許反應(yīng)順利進(jìn)行不能造成蛋白質(zhì)的不可逆變性有利于專一性修飾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾修飾反應(yīng)的類型?；捌湎嚓P(guān)反應(yīng)烷基化反應(yīng)氧化還原反應(yīng)芳香環(huán)取代反應(yīng)蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法.蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾二甲基氨基萘磺酰氯法,丹磺酰氨基酸具有強(qiáng)烈的黃色熒光,靈敏性是DNFB法的100倍.蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾巰基的氧化還原反應(yīng)可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、包涵體的復(fù)性、增加蛋白質(zhì)可溶性等。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾SDSPAGE:RefoldedvsUnfolded

ReducedOxidized蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾FigureInclusionbodiesexpressedinE.coli.蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的PEG修飾

聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修飾又稱分子的PEG化(PEGalation),是目前蛋白質(zhì)化學(xué)修飾最重要的技術(shù)之一,是用來解決或緩解蛋白和多肽在藥用過程中存在的諸多問題的有效途徑。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾PEG是由乙二醇單體聚合而成的線性高分子材料,分子組成為HO-CH2-CH2-(O-CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-OH;PEG鏈還可以與馬來酸酐進(jìn)一步共聚形成梳狀的PEG衍生物,簡稱PM。PEG分子中存在的大量乙氧基能夠與水形成氫鍵,使PEG具有良好的水溶性;分子末端剩余的羥基通過適當(dāng)方式活化后可與各類蛋白分子相偶聯(lián)。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾

由于PEG無毒,具有良好生物相容性和血液相容性,使它成為一種被廣泛使用的生物修飾材料。對(duì)于各種具有藥用潛能的蛋白來說,采用PEG修飾的目的主要有以下三個(gè)方面:(1)增加穩(wěn)定性,延長血漿半衰期;(2)降低免疫原性和抗原性;(3)降低毒副作用。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾1增加穩(wěn)定性和延長血漿半衰期一些以注射方式使用的藥用蛋白,由于在血液中存留的時(shí)間過短,在很大程度上限制了其正常藥效的發(fā)揮。通過PEG修飾,一方面增加了分子量,降低了腎臟的排泄速率;另一方面,偶聯(lián)的PEG鏈在蛋白分子表面產(chǎn)生空間位阻效應(yīng),減弱了血液中各種水解酶對(duì)蛋白的水解作用,從而有效地延長了蛋白在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的保留時(shí)間。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾2降低抗原性和免疫原性通過PEG修飾來消除免疫反應(yīng)活性,將異源性蛋白轉(zhuǎn)化為非免疫原性的藥用蛋白,主要是利用無免疫原性的PEG分子鏈與蛋白表面的基團(tuán)相偶聯(lián),進(jìn)而在蛋白表面形成一道屏障,將暴露的抗原結(jié)合位點(diǎn)屏蔽起來。分子構(gòu)型獨(dú)特的梳狀PEG具有更強(qiáng)的屏蔽功能,因而在這方面的應(yīng)用更為普遍。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾3降低毒副作用通過基因重組技術(shù)獲得的大規(guī)模生產(chǎn)的TNF-a,IL-2和IFN-g等是一類很有前途的抗腫瘤新藥。但由于它們的血漿半衰期短,為達(dá)到顯著的臨床治療效果不得不加大使用劑量,這就常常引起嚴(yán)重的毒副作用。近年來發(fā)現(xiàn),利用PEG修飾技術(shù)對(duì)這些蛋白進(jìn)行處理后,能夠大大增加其血漿穩(wěn)定性,降低使用劑量;或在大的使用劑量下降低毒副作用。近年來,PEG修飾已成為提高其抗腫瘤效能、降低毒副作用的有效手段。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾PEG對(duì)蛋白藥物修飾的研究及應(yīng)用進(jìn)展

蛋白藥物的PEG修飾已卓有成效，國際知名的制藥公司已經(jīng)或正在積極推進(jìn)蛋白藥物的PEG修飾，1991年第一種用PEG修飾的蛋白藥物PEG-ADA被FDA批準(zhǔn)上市，近幾年上市的有PEG-IFN、PEG-G-CSF、PEG-生長抑素。目前處于臨床前研究的PEG修飾的蛋白藥物有幾十種，處于臨床實(shí)驗(yàn)的有：超氧化物歧化酶（即將上市，Enzon公司）、白介素-2（Ⅱ期，Chiron公司）、水蛭素（Ⅱ期，BASFAG公司）、抗-TNF-a抗體片段（Ⅲ期，Pharmacia公司）、牛血紅蛋白（Ⅰ期，Enzon公司）、抗-PDGF抗體片段（Ⅱ期，Celltech公司）。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾TNF-a是一種頗有價(jià)值的腫瘤治療藥物,一方面直接表現(xiàn)為對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用;另一方面可激活宿主的抗腫瘤應(yīng)答并選擇性地引起腫瘤組織內(nèi)部的微循環(huán)障礙。但是,TNF-a在體內(nèi)的清除速率很快,要產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效果需要非常大的使用劑量,由此常引發(fā)一系列嚴(yán)重的毒副作用,包括發(fā)熱、組織炎癥和組織損傷,甚至是致命的內(nèi)毒素性休克樣綜合征。要將其轉(zhuǎn)化為一種有效的抗腫瘤藥物必須有效地降低毒副作用,PEG修飾正是為達(dá)到這一目的。研究表明,利用PEG5000對(duì)TNF-a進(jìn)行化學(xué)修飾,通過對(duì)修飾條件的優(yōu)化處理,不僅能夠有效減少毒副作用,還可提高其抗腫瘤活性。當(dāng)賴氨酸殘基被修飾的程度分別為29%和56%時(shí),其抗腫瘤活性分別增加了4倍和100倍。與天然TNF-a相比,修飾產(chǎn)物的分子量明顯增大,延長了藥物的有效作用時(shí)間,降低了毒副作用,促進(jìn)了它作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用。蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾FigureSchematicprotocolofPEGylationofTFN-ausingDMMAn.ReactionI,protectionofpartialaminogroupsbyDMMAn;reactionII,PEGylationtoremainedlysineaminogroups;reactionIII,regenerationofaminogroupsbyreleasingDMMAn蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾ResistanceofnativeTNF-aandPEG-TNF-a

toproteases.NativeTNF-aorPEG-TNF-awasincubatedwithtrypsin(left)orcathepsinG(right)at37°Cforindicatedtimes.Reactionswerestopped,andremainingbioactiv