非生物脅迫與蛋白質(zhì)相互作用

非生物脅迫與蛋白質(zhì)相互作用

體是一個(gè)復(fù)雜的體。生物分子如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂類、多糖等常常同類分子間或(和)不同分子間形成結(jié)構(gòu)復(fù)合體,執(zhí)行特定的生物功能。蛋白質(zhì)間的相互作用及其構(gòu)建的作用網(wǎng)絡(luò),在很多生命過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。研究蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)于深入了解細(xì)胞功能的分子機(jī)制具有重要的意義。而蛋白質(zhì)相互作用的研究可以分為實(shí)驗(yàn)性的方法技術(shù)和生物信息學(xué)的分析預(yù)測(cè)以及專業(yè)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建等。本文綜述了常用的蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)性技術(shù)的理論基礎(chǔ)、最新進(jìn)展及其優(yōu)缺點(diǎn),并繪制了多種技術(shù)的作用原理示意圖。1靈敏度和特異性不同蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)具有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),特別是在靈敏度和特異性方面。較高的靈敏度意味著可以檢測(cè)到較弱的相互作用,而高特異性則說(shuō)明初步得到的相互作用結(jié)果是比較可信的。1.1小鼠細(xì)胞和細(xì)胞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H)由Fields和Song在1989年首次建立使用。它的理論基礎(chǔ)是很多真核生物的轉(zhuǎn)錄因子如酵母Gal4由兩個(gè)具有不同功能的結(jié)構(gòu)域組成:轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcriptionalactivationdomain,AD)和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,BD)。兩種待檢測(cè)蛋白分別和AD、BD融合表達(dá),如果兩者之間存在相互作用,就有可能使AD和BD結(jié)構(gòu)域結(jié)合,行使轉(zhuǎn)錄功能(圖1)。酵母雙雜交系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、易用、費(fèi)用低廉,能檢測(cè)到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用;但酵母雙雜交系統(tǒng)也有一些缺點(diǎn),比如較高的假陽(yáng)性,不能真實(shí)反映蛋白質(zhì)在自身細(xì)胞中的相互作用,表達(dá)的融合蛋白最終要運(yùn)送到酵母細(xì)胞核,而有些蛋白可能具有其他亞細(xì)胞定位信號(hào)肽等。為了克服上述缺點(diǎn),很多改進(jìn)方法和技術(shù)使得雙雜交系統(tǒng)不僅可以運(yùn)用于酵母細(xì)胞,還可以運(yùn)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌中。Luo等分別將p53蛋白和GAL4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、SV40T抗原和VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)染共表達(dá),證明了p53和SV40T抗原存在相互作用。這種方法克服了酵母表達(dá)系統(tǒng)的限制,可以在動(dòng)物細(xì)胞體系中研究蛋白質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)的相互作用。而SplitTEV方法克服了細(xì)胞核的限制,可以研究在各個(gè)亞細(xì)胞部位發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)仍然是運(yùn)用比較多的檢測(cè)和驗(yàn)證蛋白質(zhì)相互作用的方法之一。酵母雙雜交系統(tǒng)在很多物種的蛋白質(zhì)互作組(Proteininteractome)得到了廣泛應(yīng)用,如酵母、線蟲(chóng)、果蠅、人類、水稻。1.2tap標(biāo)記的蛋白文化串聯(lián)親和純化(Tandemaffinitypurification,TAP)是一種常用的純化蛋白復(fù)合體的方法。Rigaut等在1999年首次報(bào)道了利用TAP技術(shù)分離純化蛋白復(fù)合物。此后,利用TAP技術(shù)大規(guī)模分析不同物種中蛋白質(zhì)相互作用的報(bào)道已有很多[17~19]。傳統(tǒng)的TAP標(biāo)簽蛋白由ProteinA、TEV蛋白酶可剪切序列和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(Calmodulin-bindingpeptide,CBP)組成(圖2a)。TAP技術(shù)通過(guò)兩步親和純化來(lái)減少非特異性蛋白結(jié)合。首先,TAP標(biāo)記的蛋白復(fù)合物通過(guò)第一個(gè)標(biāo)簽ProteinA特異性結(jié)合到IgG瓊脂珠,經(jīng)過(guò)清洗后,用TEV蛋白酶孵育IgG瓊脂珠以釋放結(jié)合的蛋白復(fù)合物,隨后復(fù)合物通過(guò)第二個(gè)標(biāo)簽CBP結(jié)合到鈣調(diào)蛋白瓊脂珠(Calmodulinbeads),再次清洗后,洗脫鈣調(diào)蛋白瓊脂珠結(jié)合的蛋白混合物(圖2c)。分離純化的蛋白通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜、免疫雜交等方法進(jìn)行鑒定分析。與其他方法相比,TAP具有如下優(yōu)點(diǎn):首先,TAP能減少非特異性蛋白結(jié)合;其次,TAP能保留蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的修飾和結(jié)合狀態(tài)。而TAP的缺點(diǎn)是需要較多的樣本材料來(lái)提取蛋白,價(jià)格比較昂貴,不能高效檢測(cè)到瞬時(shí)或較弱的蛋白質(zhì)相互作用。泛素化是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的豐度和功能具有重要作用。泛素化往往會(huì)在強(qiáng)變性條件下丟失,因此不能用常規(guī)方法分離純化來(lái)鑒定泛素化蛋白。Tagwerker等于2006年報(bào)道了一種新型的TAP標(biāo)簽HB,HB標(biāo)簽蛋白主要由RGSH6、6×His和BIO3個(gè)標(biāo)簽蛋白組成,能兼容強(qiáng)變性條件如8M尿素、6M氯化胍,分別使用Ni2+-Sepharose和streptavidin-agarose兩步純化HB融合蛋白;而使用HB標(biāo)記泛素后,成功從酵母中鑒定出258個(gè)泛素化標(biāo)記蛋白。另外,低分子量標(biāo)簽蛋白如SH-TAP、Flag-HA等空間結(jié)構(gòu)很小,可以盡量減少標(biāo)簽蛋白對(duì)蛋白質(zhì)互相作用可能存在的干擾。為了適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需要,研究人員開(kāi)發(fā)了不同的TAP標(biāo)簽。表1列舉了常用的TAP標(biāo)簽并簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)了其優(yōu)點(diǎn)。1.3gfp抑制劑的性質(zhì)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)利用抗體和抗原之間特異性的識(shí)別和結(jié)合,通過(guò)一步親和純化,分離出抗原蛋白和含有抗原蛋白的復(fù)合物(圖2,b和d)。商業(yè)化的通用標(biāo)簽蛋白(如Flag、HA、c-myc、ProteinA、GFP、6×His等)的單克隆抗體減少了制備步驟,縮短了實(shí)驗(yàn)周期。而將抗體直接或間接連接到親和樹(shù)脂、瓊脂珠、磁珠等固相支持物上能進(jìn)一步減少孵育時(shí)間,提高結(jié)合和析出效率。和常用的Co-IP標(biāo)簽蛋白相比,GFP蛋白相對(duì)分子量較大(27kDa),常用于和目的蛋白融合以觀察目的蛋白在細(xì)胞和組織器官中的表達(dá)分布或亞細(xì)胞定位等[33~35],很少作為Co-IP的標(biāo)簽蛋白。最近,Rothbauer等將小分子量的13kDa駱駝GFP結(jié)合多肽(GFP-bindingpeptide,GBP)共價(jià)交聯(lián)到N-羥基琥珀酰亞胺-瓊脂糖(N-hydroxysuccinimide-sepharose),并將其命名為GFP-nano-trap;利用GFP-nano-trap能特異性分離GFP融合蛋白及其復(fù)合物。隨后這種方法在擬南芥、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系、線蟲(chóng)、果蠅等都有成功報(bào)道。很多實(shí)驗(yàn)室通常積累了大量的GFP融合蛋白的轉(zhuǎn)基因材料,因此這一新型高效小抗體將會(huì)大大促進(jìn)包括蛋白質(zhì)相互作用在內(nèi)的一系列研究。Co-IP與TAP相比,同樣可以保留蛋白質(zhì)的修飾和結(jié)合狀態(tài),同時(shí)所需的樣本量較少,實(shí)驗(yàn)成本較低,減少了純化步驟,能檢測(cè)到瞬時(shí)和較弱的蛋白相互作用,但Co-IP特異性較低,洗脫混合物中往往含有較多的非特異結(jié)合蛋白。因此,Co-IP檢測(cè)到的潛在相互作用蛋白需要通過(guò)BiFC、FRET等其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。1.4gst和谷胱甘肽融合表達(dá)GSTPull-down是一種常用的研究蛋白質(zhì)在生物體外相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。GSTPull-down和免疫共沉淀基本原理相似:首先誘餌蛋白(Baitprotein)和GST蛋白(Glutathione-S-transferase)在細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞等體系中融合表達(dá),利用GST和谷胱甘肽親和樹(shù)脂之間的高親和性,將誘餌蛋白固化在樹(shù)脂上,而固化的誘餌蛋白可以捕獲細(xì)胞裂解物中的互作靶蛋白。和Co-IP相比,GSTPull-down的融合誘餌蛋白往往是在外源系統(tǒng)中表達(dá),可能會(huì)缺少某些翻譯后修飾,并且和靶蛋白的結(jié)合發(fā)生在體外環(huán)境,不能精確反映內(nèi)體的相互作用;但GSTPull-down外源表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單易用、蛋白表達(dá)周期短,且GST融合蛋白和谷胱甘肽有很高的親和性,易分離出大量融合蛋白進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。1.5檢測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)是一種檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù),在很多物種中得到了應(yīng)用。雙分子熒光互補(bǔ)原理是將熒光蛋白分成兩個(gè)無(wú)獨(dú)立功能的片段,分別與bait蛋白和prey蛋白融合表達(dá),如果bait融合蛋白和prey融合蛋白存在相互結(jié)合作用,而這種結(jié)合促使熒光蛋白的兩個(gè)片段相互作用發(fā)出熒光(圖3)。Ghosh等通過(guò)將細(xì)菌兩個(gè)反向平行的亮氨酸拉鏈分別融合到GFP的無(wú)功能的兩個(gè)片段發(fā)現(xiàn)了BiFC現(xiàn)象。Hu等在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)系中利用EYFP證實(shí)BiFC能應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的研究。隨后很多研究人員開(kāi)發(fā)了不同的熒光報(bào)告系統(tǒng),如N-terminalGFP-S65T+C-terminalCFP、mRFP1-Q66T、mCherry等。不同熒光蛋白的結(jié)合使用可以同時(shí)觀察多組蛋白組內(nèi)的相互作用。而B(niǎo)iFC-FRET將BiFC和FRET檢測(cè)技術(shù)結(jié)合,能檢測(cè)在兩蛋白相互作用的基礎(chǔ)上與第3個(gè)蛋白質(zhì)的相互作用。BiFC和其他分子互補(bǔ)技術(shù)相比,具有明顯的優(yōu)勢(shì),即能簡(jiǎn)單方便地通過(guò)觀察熒光鑒定蛋白質(zhì)相互作用,不依賴外源的熒光素或顯色劑等,能檢測(cè)到瞬時(shí)或者較弱的相互作用,并且可以檢測(cè)到相互作用的位點(diǎn)[44~46]。但BiFC也有一些缺陷,比如融合蛋白的相互結(jié)合和熒光發(fā)生有一定時(shí)間延遲,一些融合蛋白的結(jié)合是不可逆的,不能實(shí)時(shí)反應(yīng)蛋白質(zhì)的結(jié)合和分離情況。而這些缺點(diǎn)是未來(lái)BiFC技術(shù)改進(jìn)的方向。1.6作用作用研究熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)是一種檢測(cè)分子間距離的高效方法,由F?rster在1948年首先發(fā)現(xiàn),現(xiàn)已成為一種檢測(cè)細(xì)胞中分子內(nèi)或分子間相互作用的有效手段。FRET在蛋白質(zhì)相互作用研究的基本原理是分別將bait蛋白、prey蛋白與相應(yīng)的供體熒光基團(tuán)(如ECFP)和受體熒光基團(tuán)(如EYFP)融合,當(dāng)bait蛋白和prey蛋白相互結(jié)合作用時(shí),供體基團(tuán)和受體基團(tuán)兩者之間的距離很近(約10nm),供體基團(tuán)的發(fā)射光激發(fā)受體基團(tuán)發(fā)射熒光(圖4)。常用的供體熒光蛋白和受體熒光蛋白對(duì)有BFP-GFP、BFP-EGFP、CFP-YFP等。FRET與其蛋白質(zhì)互作技術(shù)相比,其優(yōu)點(diǎn)如下:能比較可靠地反映蛋白質(zhì)相互作用時(shí)的距離;能檢測(cè)到瞬時(shí)、較弱的蛋白質(zhì)相互作用;能同時(shí)檢測(cè)到兩蛋白的細(xì)胞分布和作用位點(diǎn)。而缺點(diǎn)是供體蛋白的激發(fā)光譜和受體蛋白的光譜可能存在重疊,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果;供體蛋白和受體蛋白的空間結(jié)構(gòu)較大,限制了兩者之間的距離,導(dǎo)致FRET發(fā)生效率低(約40%),且易出現(xiàn)假陰性;供體蛋白和受體蛋白的熒光亮度可能差異較大,易導(dǎo)致較高的背景信號(hào)。1.7檢測(cè)感器的組成與原理表面等離子共振分析是一種新型的生物分析技術(shù),不需要對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)傳感器實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子如蛋白質(zhì)、寡核苷酸、類脂等。此技術(shù)的核心SPR生物傳感器由3部分組成:SPR光學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、微射流卡盤、傳感器芯片。其工作原理是首先將蛋白質(zhì)(配體)固定在芯片表面,通過(guò)微射流卡盤將蛋白質(zhì)溶液輸送到芯片表面,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶液與傳感器芯片表面的配體蛋白結(jié)合和分離的全過(guò)程,最后通過(guò)配套軟件處理監(jiān)測(cè)到的信號(hào),得出最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而表面等離子共振分析和質(zhì)譜分析聯(lián)用可以鑒定出和配體蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)序列。主要優(yōu)點(diǎn)有:不需要標(biāo)記樣品、實(shí)時(shí)高效等;而缺點(diǎn)是需要分離純化配體并根據(jù)其性質(zhì)優(yōu)化與芯