酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用

酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用

近年來(lái)，stan建立了一種非常有效的蛋白質(zhì)相互作用研究方法。最重要的特點(diǎn)是，在這種快速生長(zhǎng)的、易操作的系統(tǒng)中，可以研究真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)相互作用，并通過(guò)編碼分析獲得與未知蛋白質(zhì)相互作用的序列。隨著這一方法的廣泛應(yīng)用，許多未知和重要的蛋白質(zhì)相互作用被暴露出來(lái)。同時(shí)，近年來(lái)，在現(xiàn)有的雙重母生殖器的基礎(chǔ)上發(fā)展了大量的后代系統(tǒng)：一個(gè)混合系統(tǒng)用于研究蛋白質(zhì)和dna的相互作用；相反的雙帶系統(tǒng)用于研究、解離或破壞蛋白質(zhì)相互作用的因素。不同類型的混合系統(tǒng)用于研究蛋白質(zhì)、茶多酚和小配體之間的相互作用。最新的sos富有化工系統(tǒng)是為了克服現(xiàn)有系統(tǒng)的不足。在本文中，我們介紹了雙重分子系統(tǒng)的原理和應(yīng)用發(fā)展。1dna結(jié)合功能區(qū)和激活轉(zhuǎn)錄功能區(qū)本世紀(jì)80年代末期對(duì)真核轉(zhuǎn)錄因子的研究為酵母雙雜交系統(tǒng)的創(chuàng)立提供了理論基礎(chǔ).研究證實(shí),很多真核基因的表達(dá)通常處于本底水平,一旦有轉(zhuǎn)錄激活蛋白的誘導(dǎo)則出現(xiàn)高水平表達(dá).這種轉(zhuǎn)錄激活蛋白,如酵母的GAL4等都具有兩個(gè)相互獨(dú)立的功能——與特異性DNA序列結(jié)合的功能和引導(dǎo)RNA聚合酶激活轉(zhuǎn)錄的功能.同時(shí)更重要的發(fā)現(xiàn)是:這兩個(gè)功能分別由兩個(gè)獨(dú)立的功能區(qū)域負(fù)責(zé).即DNA結(jié)合功能區(qū)(DNA-bindingdomain,DNA-BD)和激活轉(zhuǎn)錄功能區(qū)(Activationdomain,AD).前者負(fù)責(zé)結(jié)合上游順式激活序列(UpstreamActivationSequence,UAS),后者則負(fù)責(zé)引導(dǎo)RNA聚合酶復(fù)合體激活基因轉(zhuǎn)錄.DNA-BD和AD對(duì)激活轉(zhuǎn)錄是必不可少的.理論上,任何一個(gè)AD都可以與任何一個(gè)DNA-BD結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄,即雜合的DNA-BD和AD可以組成一個(gè)具有功能的轉(zhuǎn)錄激活蛋白.不僅如此,只要DNA-BD和AD能夠通過(guò)一定的方式在空間上足夠的靠近(例如借助其他蛋白質(zhì)的相互結(jié)合使其足夠靠近),即使它們之間沒(méi)有共價(jià)結(jié)合也可以激活轉(zhuǎn)錄.2擬合體質(zhì)群的檢測(cè)基于上述研究,科學(xué)家設(shè)想可以借助任何兩個(gè)能相互作用的蛋白質(zhì)為橋梁,將相互分開(kāi)的DNA-BD和AD在空間上使它們彼此靠近,并重建一個(gè)具有功能的轉(zhuǎn)錄激活蛋白.這樣,促使FieldS和SongO最終創(chuàng)立了酵母雙雜交系統(tǒng)(圖1).目前最成熟也最常用的DNA-BD和AD均來(lái)自酵母的GAL4蛋白質(zhì)(它們分別定位于aa1-147和768-881).將編碼已知蛋白質(zhì)(常稱為誘餌蛋白質(zhì),Baitprotein)的基因與編碼BD的序列融合并在酵母中表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白BD-Bait,同時(shí)將編碼末知蛋白(該蛋白常稱為Prey)的基因與編碼AD的序列融合并在酵母中表達(dá)產(chǎn)生另一融合蛋白AD-Prey,借助Bait和Prey的作用使BD和AD相互結(jié)合并產(chǎn)生具有功能的轉(zhuǎn)錄激活蛋白,從而激活報(bào)導(dǎo)基因.如果Prey-Bait不能相互作用,則BD和AD不能結(jié)合,報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄則不能被激活,因此,可以通過(guò)檢測(cè)報(bào)導(dǎo)基因是否被轉(zhuǎn)錄來(lái)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用.與許多傳統(tǒng)的方法相比,酵母雙雜交系統(tǒng)具有重大的突破:首先,整個(gè)操作均在體內(nèi)進(jìn)行(invivo),避開(kāi)了傳統(tǒng)的體外方法(invitro)中實(shí)驗(yàn)技術(shù)、條件對(duì)研究的不利影響;其次具有高靈敏度,尤其在檢測(cè)蛋白質(zhì)之間弱相互作用時(shí)更為突出.3報(bào)道基因的選擇許多DNA激活蛋白包括原核激活蛋白的DNA-BD均可被用于酵母雙雜交系統(tǒng),最常用的DNA-BD是GAL4和LEX蛋白的DNA-BD,而最常用的AD則是GAL4和HSVVP16蛋白的AD.報(bào)導(dǎo)基因應(yīng)該包括操縱子或者DNA-BD能夠識(shí)別并結(jié)合的DNA序列如UAS.從理論上講,任何能在酵母中表達(dá)的基因都可以作報(bào)導(dǎo)基因,較為常用的是LacZ,可以非常清楚地利用在X-gal存在時(shí)的顏色反應(yīng)來(lái)篩選陽(yáng)性克隆.比LacZ更為有效的是營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記,這種報(bào)導(dǎo)基因僅僅允許陽(yáng)性克隆生長(zhǎng),因而更敏感、更實(shí)用.最常用的是His2和Leu.當(dāng)然許多科學(xué)家更趨向于使用兩種或兩種以上的報(bào)導(dǎo)基因從而更靈敏、更準(zhǔn)確地篩選陽(yáng)性克隆.4母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)是一個(gè)具有開(kāi)創(chuàng)意義的研究方法,已經(jīng)廣泛地運(yùn)用在分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,其最主要的用途有以下4個(gè)方面.4.1sv0基因缺失菌株多態(tài)性鑒定酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)立之初就是為了用來(lái)研究已知蛋白質(zhì)之間的相互作用.目前,通過(guò)該系統(tǒng)已經(jīng)確定了許多重要蛋白質(zhì)之間的相互作用,如利用該系統(tǒng)證實(shí)SV40的大T抗原可以與P53蛋白和R6蛋白相互作用,從而揭示了SV40引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)理;利用該系統(tǒng)證實(shí)了真核細(xì)胞的XRCC4基因產(chǎn)物能夠與DNA連接酶IV相互作用形成復(fù)合體,然后作為免疫球蛋白成熟過(guò)程中V、J、D基因重排的信號(hào)直接促使基因重排和連接,最后產(chǎn)生具有功能的免疫球蛋白基因;在癌癥起因的研究中,原癌基因編碼的蛋白質(zhì)功能尤為重要.酵母雙雜交系統(tǒng)是目前最有效的研究方法,利用該系統(tǒng)已經(jīng)研究了多種原癌基因產(chǎn)物與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的相互作用,如原癌基因產(chǎn)物RAS與絲氨酸/蘇氨酸激酶RAF的相互作用,為最終破譯癌癥的起因積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).4.2tnf-r族細(xì)胞的結(jié)構(gòu)突變酵母雙雜交系統(tǒng)是確定蛋白質(zhì)作用功能區(qū)域(位點(diǎn))的最有效的方法.當(dāng)我們確定了兩種蛋白質(zhì)存在相互作用后,可以利用分子克隆技術(shù)將其中一種蛋白質(zhì)進(jìn)行一系列缺失突變,然后確定蛋白質(zhì)之間相互作用的變化,從而確定蛋白質(zhì)相互作用的重要功能區(qū)域,還可將蛋白質(zhì)進(jìn)行一系列的點(diǎn)突變以進(jìn)一步確定影響蛋白質(zhì)相互作用的重要氨基酸位點(diǎn).KistonJ利用該系統(tǒng)研究了多種TNF-R族的細(xì)胞表面受體,發(fā)現(xiàn)它們均含有一個(gè)保守的由70～80個(gè)氨基酸組成的“死亡區(qū)域”,該“死亡區(qū)域”是引發(fā)細(xì)胞凋亡(apoptosis)的重要信號(hào)之一,并同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的具有“死亡區(qū)域”的TNF-R族的表面受體WSL-1蛋白(DR3/APO-3).4.3化合物的功能酵母雙雜交系統(tǒng)的最為重要的用途就是從cDNA文庫(kù)中尋找與已知蛋白質(zhì)相互作用的未知蛋白質(zhì),將cDNA與AD序列相互融合,將已知蛋白基因與DNA-BD序列結(jié)合,檢測(cè)報(bào)導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄情況,尋找與已知蛋白質(zhì)能相互作用的未知蛋白質(zhì),該方法已經(jīng)證實(shí)了許多未知的蛋白質(zhì)相互作用,揭示了大量未知蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控機(jī)制.YonganL發(fā)現(xiàn)腺病毒E3所編碼的E3-14.7×103蛋白質(zhì)能抑制TNF-α的功能,利用酵母雙雜交系統(tǒng)從Hela細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中找到了一個(gè)特殊的宿主蛋白FIP-2,它是E3-14.7×103在細(xì)胞內(nèi)的靶蛋白,E3-14.7×103通過(guò)與FIP-2結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)TNF-α的抑制功能,從而揭示了腺病毒能夠抑制腫瘤壞死因子功能的機(jī)理;乙肝病毒X基因的表達(dá)產(chǎn)物HBX是一個(gè)功能復(fù)雜的蛋白質(zhì),它在病毒的感染、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中均起重要作用.MelegariM利用酵母雙雜交系統(tǒng)從cDNA文庫(kù)中找到與HBX結(jié)合的宿主蛋白IXP,證實(shí)IXP能夠通過(guò)與HBX的結(jié)合抑制其活性從而改變病毒的復(fù)制周期,為研究HBV感染機(jī)制及治療提供了有用的信息.4.4酵母雙雜交系統(tǒng)所應(yīng)用的藥物在治療腫瘤和病毒病、細(xì)菌病的方法中,基因治療是最先進(jìn)的、也是最具前途的方法,而基因治療中最常用的“藥物”就是“多肽”.利用酵母雙雜交系統(tǒng)可以確定治療用多肽與腫瘤、細(xì)菌、病毒來(lái)源的蛋白質(zhì)的相互作用,從而精密揭示藥物與細(xì)胞、組織、機(jī)體的相互作用,以確定基因治療的分子機(jī)理,大大縮短實(shí)驗(yàn)到臨床應(yīng)用的時(shí)間.5酵母雙雜交系統(tǒng)在生物化學(xué)史上用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法很多,如交聯(lián)、免疫、共沉淀、親和層析等,這些傳統(tǒng)的方法均采用體外實(shí)驗(yàn)(invitro)來(lái)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,所以在研究蛋白質(zhì)相互作用的過(guò)程中受到許多外界實(shí)驗(yàn)條件、環(huán)境、方法的影響,同時(shí)傳統(tǒng)方法一般需要高濃度的蛋白質(zhì)或抗體,純化非常困難,會(huì)造成許多假陽(yáng)性,而且無(wú)法精確測(cè)定蛋白質(zhì)之間弱的相互作用.酵母雙雜交系統(tǒng)徹底改變了傳統(tǒng)方法(圖2:A),采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(invivo)來(lái)研究蛋白質(zhì)的相互作用,方法精確,不受外界影響,易于操作;更重要的是,所有操作均在核酸水平進(jìn)行,無(wú)需純化大量的蛋白質(zhì),可以精確測(cè)定蛋白質(zhì)的弱相互作用;另一方面,酵母雙雜交系統(tǒng)中的誘餌蛋白可以是完整的蛋白質(zhì),也可以是蛋白質(zhì)的一個(gè)功能區(qū),可以大到一個(gè)完整的腫瘤抑制蛋白,也可以小到一個(gè)約22個(gè)氨基酸的多肽,這更擴(kuò)大了它的運(yùn)用范圍.盡管如此,酵母雙雜交系統(tǒng)仍有一定的局限性.首先,該系統(tǒng)要求Bait蛋白能夠被穩(wěn)定地表達(dá)成融合蛋白,且該融合蛋白必須能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi),因而不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)如細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞膜蛋白的相互作用的研究就不宜用該系統(tǒng);同時(shí)如果某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)是經(jīng)過(guò)翻譯后加工才能相互作用,則該系統(tǒng)也不適用,因?yàn)榻湍傅暮蠹庸は到y(tǒng)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞后加工系統(tǒng)不盡相同.鑒于以上的不足,人們正在不斷地改造酵母雙雜交系統(tǒng),因而近年來(lái)由該系統(tǒng)衍生出許多新的系統(tǒng):一方面,為了研究膜蛋白的相互作用,Aronheimetal(1997)改造酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)立了SOS募集系統(tǒng)(SOSrecruitmentsystem,SRS)(圖2:B).在該系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)之間的相互作用被人為限制在酵母細(xì)胞膜上.酵母鳥(niǎo)苷酸交換因子(GEF)在正常情況下可以富集于細(xì)胞膜上并激活Ras蛋白,產(chǎn)生Ras途徑,酵母能正常生長(zhǎng).但SRS系統(tǒng)中利用了GEF溫度敏感型酵母突變株,該突變株在36℃不能生長(zhǎng).如果將人的GEF即SOS蛋白引入酵母突變株并富集在膜上則可以代替突變的酵母GEF,使突變株能生長(zhǎng).在SRS系統(tǒng)中,SOS蛋白與蛋白質(zhì)Bait融合表達(dá),蛋白質(zhì)Prey與豆蔻?；盘?hào)融合表達(dá)被定位于細(xì)胞膜上,蛋白質(zhì)Bait-Prey的相互作用使得SOS蛋白能接近細(xì)胞膜并激活膜上的Ras蛋白,產(chǎn)生Ras途徑,使突變株在36℃可以生長(zhǎng),反之則不能生長(zhǎng).利用SRS系統(tǒng)可以研究不能進(jìn)入細(xì)胞核的蛋白質(zhì)的相互作用.另一方面,為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)不能研究需翻譯后加工的蛋白質(zhì)相互作用的缺陷,VidalM已經(jīng)建立了哺乳動(dòng)物的雙雜交系統(tǒng),當(dāng)然該系統(tǒng)還存在許多不足.同時(shí)也可以利用激酶三雜交系統(tǒng)來(lái)研究需翻譯后加工的蛋白質(zhì).在彌補(bǔ)不足的同時(shí),科學(xué)家為了拓寬傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用范圍也創(chuàng)立了許多新的系統(tǒng).目前最為成功的是三雜交系統(tǒng)(Three-HybridSystem)和逆向雙雜交系統(tǒng)(ReverseTwo-HybridSystem).5.1種分子的相互作用三雜交系統(tǒng)利用了雙雜交系統(tǒng)中的兩個(gè)融合蛋白AD-Prey和BD-Bait,同時(shí)這兩個(gè)融合蛋白的相互作用必須借助于第三種分子(見(jiàn)圖2:C),而這第三種分子可以是蛋白質(zhì)、小分子多肽和核酸,因而產(chǎn)生了蛋白質(zhì)三雜交系統(tǒng)、激酶三雜交系統(tǒng)、小配體三雜交系統(tǒng)、RNA三雜交系統(tǒng)等.(1)誘導(dǎo)三種蛋白質(zhì)的相互作用該系統(tǒng)仍沿用雙雜交系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)Bait和Prey,但其穩(wěn)定的相互作用必須借助于第三種蛋白質(zhì)Z,Z可以介導(dǎo)Bait-Prey的相互作用或者誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化促使兩者的穩(wěn)定結(jié)合.(2)激酶作化酶如前所述,該系統(tǒng)可以被用來(lái)研究需翻譯后加工的蛋白質(zhì).該系統(tǒng)利用酪氨酸蛋白激酶將其中一種蛋白質(zhì)在特定位置上的酪氨酸磷酸化,磷酸化以后的蛋白質(zhì)才能與另一種蛋白質(zhì)相互作用.這種方法不僅僅局限于蛋白質(zhì)的磷酸化作用,它可以引入多種翻譯后修飾因子如甲基化酶、糖基化酶來(lái)研究需翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的相互作用.(3)d-bait重及d-bait重序它是用來(lái)研究RNA與蛋白質(zhì)相互作用的.首先與傳統(tǒng)方法一樣將蛋白質(zhì)Bait與BD結(jié)合產(chǎn)生融合蛋白BD-Bait,將蛋白質(zhì)Prey與AD結(jié)合產(chǎn)生融合蛋白AD-Prey,Bait與Prey不能相互作用,但Bait可以與一種RNA分子的部分序列結(jié)合,以此來(lái)檢測(cè)該RNA分子的其他序列與未知蛋白Prey的相互作用.另外還有多肽三雜交系統(tǒng)和小配體三雜交系統(tǒng),均是借助第三者的介導(dǎo)研究蛋白質(zhì)的相互作用.5.2蛋白間相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)立的宗旨是研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,但在實(shí)際中阻斷蛋白質(zhì)之間的相互作用的研究也非常重要.例如在癌癥的研究中,如何阻斷癌基因產(chǎn)物與宿主蛋白之間的相互作用,以及癌細(xì)胞之間信息的傳遞等都非常重要.Shihetal創(chuàng)立了研究如何阻斷蛋白質(zhì)之間相互作用的逆向雙雜交系統(tǒng)(見(jiàn)圖3).他在原系統(tǒng)中引入了E.coli的含有Tet-阻遏子(TetR)的操縱元和報(bào)道基因His3.如果兩種蛋白質(zhì)能相互作用,則激活TetR的轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合到His3上游的Tet操縱元上,阻斷了His3的表達(dá),酵母菌表現(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)缺陷型;如果由于蛋白質(zhì)的突變或其他分子的介入阻斷了蛋白質(zhì)的相互作用,則TetR不能被激活轉(zhuǎn)錄,His3能被正常表達(dá).作者已成功地應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)阻斷cAMP效應(yīng)分子結(jié)合蛋白(CREB)與輔助激活因子(CBP)相互作用的化學(xué)及生物誘變劑進(jìn)行了研究.5.3酵母雙雜交互交系統(tǒng)s單雜交系統(tǒng)(one-hybridsystem)(見(jiàn)圖2:A):最早由雙雜交系統(tǒng)改造而來(lái)的新系統(tǒng)是單雜交系統(tǒng).將蛋白質(zhì)Prey與AD融合