外周血松胞素阻滯微核法預(yù)測(cè)鼻咽癌放射敏感性的前瞻性研究

外周血松胞素阻滯微核法預(yù)測(cè)鼻咽癌放射敏感性的前瞻性研究

采用松細(xì)胞肺癌包裹微核法（cbnna）測(cè)定第一次細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生的兩個(gè)細(xì)胞及其中間微核，以反映染色體碎片或缺失的情況。我們用外周血淋巴細(xì)胞CBMNA前瞻性研究微核率及微核細(xì)胞率與放射治療急性反應(yīng)、50Gy鼻咽腫瘤消退率、放療后3個(gè)月腫瘤射野內(nèi)消退狀況等,探討CBMNA的微核率、微核細(xì)胞率預(yù)測(cè)鼻咽癌正常組織放射敏感性及腫瘤組織放療反應(yīng)的可行性。材料和方法1.藥品、動(dòng)物血凝素等f(wàn)4-1、3ga松胞素B、吉姆薩粉為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品,植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)為廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品,F34-1型深部X線機(jī)由北京東方紅醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。2.納入及排除標(biāo)準(zhǔn)入組標(biāo)準(zhǔn):(1)初治原發(fā)鼻咽癌患者,活檢為鼻咽未分化型非角化性癌(WHO),無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,Karnofsky評(píng)分80分以上;(2)放療期間接受單純根治性放療;(3)愿意接受本課題要求的3次外周血檢查、鼻咽和或頸MRI檢查,簽署知情同意協(xié)議者;(4)由我科報(bào)務(wù)臺(tái)安排給本研究的連續(xù)鈷機(jī)放療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)放療期間出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,中止放療者;(2)未能按本課題要求完成3次外周血檢查、MRI檢查;(3)放療期間除根治性放療外,又行其他抗癌治療者。2005年9月23日至2006年3月17日共有46例患者進(jìn)入本研究,1例放療期間出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,1例放療期間頸部淋巴結(jié)增大,科內(nèi)會(huì)診要求加同期化療及熱療增敏,2例因經(jīng)濟(jì)原因拒絕行第三次MRI復(fù)查,此4例排除出本研究,共有42例進(jìn)入總結(jié)。男32例,女10例。年齡21～74歲,平均(46.83±12.64)歲。有煙癮者26例,無(wú)煙癮者16例。T分期:T1期2例,T2期13例,T3期20例,T4期7例。N分期:N0期6例,N1期22例,N2期13例,N3期1例。Ⅰ期2例,Ⅱ期10例,Ⅲ期23例,Ⅳ期7例。3.患者臨床檢查治療方案按我科鼻咽癌治療規(guī)范,T4、N2、N3患者放療前誘導(dǎo)化療1～2療程,PF方案:DDP20mg/m2,d1～d5;5-Fu500mg/m2,d1～5。外照射時(shí)除頸后電子線照射用直線加速器外,余射野均用鈷機(jī),每野次劑量200cGy,第一段面頸聯(lián)合野+下頸前野36Gy;第二段加量至60Gy,若咽后腫大淋巴結(jié)達(dá)口咽平面或頸部淋巴結(jié)大、靠近乳突者,兩側(cè)行鈷機(jī)后界前移的面頸聯(lián)合野,頸后野用直線加速器電子線照射淋巴結(jié)區(qū),其他患者用鈷機(jī)面頸分野;第三段外照射60Gy后加量,T1、無(wú)咽后腫大淋巴結(jié)的T2期患者,加鼻咽后裝近距離照射,雙氣囊施源器,每氣囊充氣量3ml,源外1cm5Gy/次,治療活性長(zhǎng)度1cm,共3次。余患者行縮小的耳前野加量至70Gy,若顱底腫瘤破壞明顯者,加顱底小野6Gy。頸淋巴結(jié)區(qū)預(yù)防劑量50Gy,腫大淋巴結(jié)區(qū)加量至60～70Gy。本組病例中9例行2程、6例行1程PF化療,化療后2～4周始行根治性放療;2例T1、5例T2患者在外照射60Gy后加鼻咽后裝放療15Gy,余35例患者行常規(guī)外照射,8例行頸后電子線照射,鼻咽劑量70～76Gy,頸部劑量50～70Gy。放療前常規(guī)檢查鼻咽MRI和(或)頸部MRI;外照射50Gy、放療結(jié)束后3個(gè)月復(fù)查鼻咽MRI檢查和(或)頸部B超或頸部CT/MRI檢查。外照射前、20Gy、60Gy時(shí)分別用肝素抗凝管抽取靜脈血3ml。每周2次臨床檢查,記錄患者皮膚、口咽黏膜RTOG/EORTC急性放射并發(fā)癥Ⅱ級(jí)初始出現(xiàn)時(shí)的外照射劑量。RTOG/EORTC急性放射并發(fā)癥Ⅱ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)皮膚:明顯紅斑/斑點(diǎn)狀濕性脫皮,中度水腫;(2)黏膜:斑點(diǎn)狀黏膜炎伴漿液性滲出,中度疼痛,需用止痛藥。4.小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)(1)取血標(biāo)本:每一例患者外照射前、20、60Gy時(shí)用肝素抗凝管分別抽取靜脈血3ml。在超凈工作臺(tái)上吸取血標(biāo)本0.4ml加入預(yù)裝有4.6ml20%胎牛血清1640PHA培養(yǎng)液西林瓶中。(2)深部X線機(jī)照射:外照射前的血標(biāo)本分裝成5份,分別在深部X線機(jī)下照射0,0.5,1,2,4Gy,條件:210kV,12mA,0.52mmCu,劑量率96.6cGy/min,限光筒大小:10cm×15cm,把需照射區(qū)域置于射野中心。(3)血標(biāo)本培養(yǎng):X線機(jī)照射完后的血標(biāo)本、20Gy、60Gy時(shí)抽取的血標(biāo)本放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。44h后加入松胞素B,終濃度為6μg/ml,搖勻后放入培養(yǎng)箱,72h終止培養(yǎng)。(4)低滲、固定、制片:用吸管小心吸去上清液,加入0.075molKCl低滲液5ml,吹打混勻后,倒入10ml離心管,在37℃水浴箱恒溫5min,加入5∶1甲醇∶丙醋酸2ml預(yù)固定,吹打均勻,22℃室溫靜置10min,1500r/min離心10min,吸去上清液,再加入5∶1甲醇∶丙醋酸5ml,吹打均勻,室溫靜置20min,1500r/min離心10min,吸去上清液,最后加入5∶1甲醇∶丙醋酸5ml,吹打均勻,室溫靜置20min,1500r/min離心10min,吸去上清液,使試管內(nèi)液體殘留至0.4ml,吹打混勻后,取出預(yù)置于-20℃冰箱內(nèi)的病理玻片,每片滴3～4滴,空氣干燥。(5)染色、閱片、計(jì)數(shù)雙核細(xì)胞微核率及微核細(xì)胞率:用新鮮配制的10%吉姆薩工作液30ml倒入染色盒內(nèi),染色20min。按Fenech計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞微核的方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。微核的標(biāo)準(zhǔn)為:位于主核大小一致的雙核細(xì)胞胞漿內(nèi),核膜獨(dú)立或條帶(核漿橋)相連;微核直徑是主核的1/16～1/3;圓形或卵圓形,染色與主核相同,可與主核分開(kāi);無(wú)折光性,可與偽影分開(kāi)。在1000倍油鏡下觀察,每張玻片計(jì)數(shù)1000個(gè)雙核細(xì)胞,全片若不夠1000個(gè)雙核細(xì)胞,則按實(shí)際片上所有的雙核細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)雙核細(xì)胞微核率及微核細(xì)胞率。5.y時(shí)截面積高黎等報(bào)道,50Gy鼻咽腫瘤組織消退率(decreasedarearateatthedose50Gy,dA50)=(0Gy時(shí)截面積-50Gy時(shí)截面積)/0Gy時(shí)截面積,0Gy截面積指在放療前增強(qiáng)MRI橫斷面、矢狀面或冠狀面上最大橫徑A與其垂直徑B乘積,50Gy時(shí)截面積指與0Gy相應(yīng)層面上的橫徑與其垂直徑乘積。放療前腫瘤體積指0Gy時(shí)截面積×C,若截面積取自橫斷面,則C指矢狀面或冠狀面上最大上下徑;若截面積取自矢狀面,則C指橫斷面上最大左右徑;若截面積取自冠狀面,則C指橫斷面上最大前后徑。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件行結(jié)果分析。兩組資料比較采用t檢驗(yàn),列聯(lián)表計(jì)數(shù)資料采用crosstabpearson卡方檢驗(yàn)。指標(biāo)間分析采用相關(guān)分析及偏相關(guān)分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.級(jí)反應(yīng)的初始劑量的確定出現(xiàn)皮膚RTOG/EORTCⅡ級(jí)反應(yīng)的初始劑量為(52.36±10.37)Gy,中位劑量52Gy,口腔黏膜RTOG/EORTCⅡ級(jí)反應(yīng)的初始劑量為(45.31±15.76)Gy,中位劑量48Gy,皮膚Ⅱ級(jí)反應(yīng)的初始劑量與黏膜Ⅱ級(jí)反應(yīng)的初始劑量有明顯的相關(guān)性(γ=0.542,P=0.000)。因各個(gè)體射野內(nèi)皮膚、黏膜受量可達(dá)到50Gy,定義等于或低于處方劑量50Gy外照射時(shí)出現(xiàn)皮膚或黏膜RTOG/EORTCⅡ級(jí)反應(yīng)者為放療急性反應(yīng)敏感組(25例),反之為放療急性反應(yīng)不敏感組(17例),分兩組資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2.病例全消率統(tǒng)計(jì)鼻咽癌患者在放療后3個(gè)月經(jīng)臨床檢查、B超、CT/MRI檢查發(fā)現(xiàn)鼻咽或頸部腫瘤病灶,并經(jīng)鼻咽鏡活檢或頸淋巴結(jié)活檢確診癌細(xì)胞殘存者,定義為殘留組,其他為局控組。本組病例放療后3個(gè)月鼻咽、頸部病灶全消率34/42(80.9%)。局控組34例,殘留組8例,分成兩組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),急性反應(yīng)敏感與腫瘤局控呈明顯正相關(guān)(r=0.465,P=0.002)。3.體外照射mrcf的實(shí)驗(yàn)結(jié)果雙核細(xì)胞微核率(MNF)在X線照射0,0.5,1,2,4Gy和體外照射20Gy、60Gy時(shí)分別為0.0147±0.0115、0.0401±0.0164、0.0853±0.0314、0.2274±0.0745、0.5321±0.1573、0.1254±0.0246和0.1689±0.0392。雙核細(xì)胞微核細(xì)胞率MNCF在X線照射0,0.5,1,2,4Gy,體外照射20Gy、60Gy時(shí)分別為0.0136±0.0099、0.0346±0.0149、0.0773±0.0295、0.2113±0.0699、0.4951±0.1514、0.1171±0.0238、0.1575±0.0360;隨劑量增加,MNF及MNCF均明顯增加(P=0.000)。淋巴細(xì)胞微核見(jiàn)圖1,2。4.最大截面積腫瘤退行性實(shí)驗(yàn)放療前MRI檢查:鼻咽腫瘤體積(49.58±51.59)cm3,0,50Gy時(shí)最大截面積分別為(12.38±9.07)cm2和(4.54±5.49)cm2,腫瘤消退率為0.6865±0.2226(圖3,4)。5.正常組織急性反應(yīng)、化療及放療特征與腫瘤局控的關(guān)系正常組織急性反應(yīng)、腫瘤近期消退狀況與MNF、MNCF的關(guān)系見(jiàn)表1,2。由表1可見(jiàn),在體外照射1Gy及以上劑量、20Gy、60Gy時(shí)外周血微核率在放射敏感組明顯比不敏感組增加(P<0.01),但在放療前自發(fā)性微核率、0.5Gy小劑量照射下誘發(fā)的微核率在兩組間差異無(wú)顯著性。在體外照射2Gy及以上劑量、20Gy、60Gy時(shí)外周血微核率在腫瘤局控組比殘留組明顯增加(P<0.05),但在放療前自發(fā)性微核率、0.5Gy及1Gy小劑量照射下誘發(fā)的微核率在兩組間差異無(wú)顯著性。由表2可見(jiàn),在體外照射1Gy及以上劑量、20Gy、60Gy時(shí)外周血微核細(xì)胞率在放射敏感組明顯比不敏感組增加(P<0.01),但在放療前自發(fā)性微核率、0.5Gy小劑量照射下誘發(fā)的微核率兩組間差異無(wú)顯著性。在體外照射2Gy及以上劑量時(shí)、60Gy時(shí)腫瘤局控組外周血微核細(xì)胞率比殘留組明顯增加(P<0.05),但在放療前自發(fā)性微核率、0.5Gy及1Gy小劑量照射下誘發(fā)的微核率兩組間差異無(wú)顯著性。正常組織急性反應(yīng)、腫瘤近期消退狀況與分期、化療、放療前體積、50Gy腫瘤消退率、年齡、性別之間的關(guān)系見(jiàn)表3。從表3可以看出,皮膚、黏膜放射敏感組年齡明顯較不敏感組大(P=0.039)?；煰煶躺僬咚坪醺舾?這不符合常理。由于是否化療取決于T、N分期,T4、N2、N3者行誘導(dǎo)化療,因此化療是非獨(dú)立因素。行偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),在控制T、N的情況下,化療與腫瘤放療反應(yīng)的偏相關(guān)系數(shù)為-0.2651,P=0.098,兩者無(wú)明顯相關(guān)性。腫瘤總分期、T、N分期、放療前腫瘤體積、50Gy腫瘤消退率、性別在皮膚、黏膜放射敏感組與不敏感組間比較,差異無(wú)顯著性。局控組50Gy腫瘤消退率明顯比殘留組更大,局控組年齡也明顯比殘留組更大?；煰煶淘缴僬咚坪蹙挚芈矢?這不符合常理?？紤]到T4、N2、N3者行誘導(dǎo)化療,化療與T、N分期有關(guān),是非獨(dú)立因素,行偏相關(guān)分析,在控制T、N后,化療與腫瘤局控的偏相關(guān)系數(shù)-0.2601,P=0.105;控制化療因素后,N與腫瘤局控的偏相關(guān)系數(shù)-0.2149,P=0.177;可見(jiàn)在本組病例中,N分期、化療療程數(shù)與放療后3個(gè)月腫瘤局控?zé)o相關(guān)性。腫瘤總分期、T分期、放療前腫瘤體積、性別在腫瘤組織局控組與殘留組間比較,差異無(wú)顯著性。6.腫瘤刑事計(jì)劃微核率與腫瘤各功能間的相互作用性別、年齡、總分期、化療、放療前腫瘤體積、50Gy腫瘤消退率、2Gy時(shí)微核率的相互關(guān)系見(jiàn)表4。從表4可以看出,分期與化療(r=0.539)、分期與腫瘤體積(r=0.403)呈明顯正相關(guān),余因素間無(wú)相關(guān)性。外周血淋巴細(xì)胞放療后微核試驗(yàn)及適應(yīng)證Fenech等、Lee等指出,選擇外周血淋巴細(xì)胞輻射損傷檢測(cè)有以下優(yōu)點(diǎn):(1)為放射敏感細(xì)胞,可被小劑量射線損傷,而其他體細(xì)胞敏感性較差;(2)外周血淋巴細(xì)胞持續(xù)全身循環(huán),可通過(guò)放射野,可作全身射線吸收劑量的生物劑量?jī)x;(3)體外試驗(yàn)時(shí)放射反應(yīng)及放射防護(hù)劑效應(yīng)與體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)高度一致;(4)易于獲取,在促有絲分裂劑植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激下從G0期轉(zhuǎn)化成M期,表達(dá)出染色體的損傷;(5)敏感性好,可檢測(cè)出5cGy劑量差異;⑹染色體損傷后數(shù)月甚至數(shù)年仍可通過(guò)外周血CBMNA檢測(cè)到。因此,在檢測(cè)正常組織放射損傷、放射防護(hù)劑、放射增敏劑、致DNA或染色體損傷的化學(xué)物質(zhì)效應(yīng)等方面,國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室行松胞素阻滯微核法檢測(cè)時(shí)均采用外周血淋巴細(xì)胞,本課題也不例外。Odagiri等對(duì)124例志愿者外周血照射0Gy、2Gy后行CBMNA檢測(cè)微核率,發(fā)現(xiàn)0Gy時(shí)變異不大,但2Gy照射后,微核率差異明顯,與年齡、性別無(wú)相關(guān)性,與個(gè)體的內(nèi)在放射敏感性相關(guān)。Cao等對(duì)9例單純放射治療的鼻咽癌患者外照射0,4,10,28,48,68Gy時(shí)抽外周血檢測(cè),發(fā)現(xiàn)CBMNA是最敏感檢測(cè)方法,優(yōu)于彗星法及染色體畸變法,在外照射4Gy時(shí)外周血微核率即增高,28Gy時(shí)明顯增高,推薦外周血CBMNA為檢測(cè)放射后染色體損傷的首選方法。Lee等對(duì)38例前列腺癌患者檢測(cè)外周血CBMNA微核率,隨訪(32.8±4.6)個(gè)月,發(fā)現(xiàn)直腸反應(yīng)Ⅰ級(jí)及以下者25例,Ⅱ級(jí)及以上者13例,微核率在照射1Gy時(shí)即有差異,2Gy以上時(shí)有明顯差異,提示放療前CBMNA微核率可預(yù)測(cè)前列腺癌患者放射治療后正常組織放