量子點免疫層析檢測技術

量子點免疫層析檢測技術方興未艾免疫層析技術是一種快速、簡便、靈敏、直觀、價格低廉、可真正實現(xiàn)現(xiàn)場檢測的檢測方法。具有很多氣相色譜、高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用色譜、液質(zhì)聯(lián)用色譜、毛細管電泳等儀器檢測方法以及其他傳統(tǒng)方法無法企及的優(yōu)點。在檢測領域中處于特殊重要的地位，同時也是傳統(tǒng)檢測和儀器檢測的良好補充。尤其在經(jīng)濟高速開展，生活水平提高的今天，人類重大疾病，環(huán)境污染，食品平安等問題日益受到極大的關注，讓免疫層析檢測技術更具有巨大的潛力和蓬勃的生命力。目前，免疫層析產(chǎn)品主要為膠體金免疫層析試紙條，其最早應用于醫(yī)學檢驗，在早孕檢測中的應用取得了極大的成功，隨后在各個領域迅速滲透漫延，其在毒品檢測、環(huán)境檢測、以及食品平安檢測領域得到了迅速的開展，但是又出現(xiàn)新的問題，在很多方面，尤其是食品平安檢測領域，有些農(nóng)獸藥殘留限度極度苛刻，甚至要求0.1ng/ml的檢測限度，同時食品類物質(zhì)如肉類、禽類、果蔬、谷物等成分復雜，前處理難度也很大，造成膠體金免疫層析檢測靈敏度無法勝任。除了進一步提高前處理方法以外，尋求高靈敏度的免疫層析方法也顯得尤為重要。量子點是近20年來開展起來的半導體納米晶材料，因為它的優(yōu)良特性，受到了很大的關注，并且已經(jīng)顯示出一定的潛力，近幾年來從細胞標記等應用已逐漸開始向多個領域的檢測與診斷方向滲透。一、量子點特性量子點（簡稱QDs,又稱半導體納米粒子）是由II?丑族或III?V族元素組成的，半徑小于或接近于激光玻爾半徑，能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的一類半導體納米顆粒，其中研究較多的主要是CdX（x=S、Se、Te），直徑約為2nm-6nm。量子點由于存在顯著的量子尺寸效應和外表效應，從而使它具有常規(guī)材料所不具備的光吸收特性，使其應用領域越來越廣泛，特別是其在免疫生物學和臨床檢驗學等研究中的潛在的應用價值，已引起了廣闊科學工作者的極大關注，發(fā)光量子點作為熒光試劑探針標記生物大分子，正是近年來迅速開展的納米材料在生物分析領域的重要應用之一。與普通的熒光染料相比擬，量子點具有以下特點：（1） 有機染料熒光分子激光譜帶較窄，每一種熒光分子必須用適宜能量的光來激發(fā)，而且產(chǎn)生的熒光峰較寬，不對稱，有些拖尾。這給區(qū)分不同的探針分子帶來困難，很難利用有機染料分子同時檢測多種組分。量子點由于量子限域效應使其激發(fā)波長的范圍很寬，可以被波長短于發(fā)射光的光（一般短10nm以上）激發(fā)，并產(chǎn)生窄（半波寬約13nm）而對稱的發(fā)射光譜，從而防止了相鄰探測通道的串擾。（2） 量子點具有調(diào)色〃功能，不同粒徑大小的量子點具有不同的顏色，激發(fā)量子點的激發(fā)波長范圍很寬，且連續(xù)分布，所以可以用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點而獲得多種顏色標記，是一類理想的熒光探針。（3） 量子點的熒光強度強，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強，Chan和Nie通過實驗證明ZnS包覆的CdSe比羅丹明6G分子要亮20倍和穩(wěn)定100-200倍，可以經(jīng)受屢次激發(fā)，且標記后對生物大分子的生理活性影響很小，因此為研究生物大分子之間

的長期作用提供了可能。生物相容性好，尤其是經(jīng)過各種化學修飾之后，可以進行特異性連接，細胞毒性低，對生物體危害小，可進行生物活體標記和檢測，而傳統(tǒng)的有機熒光染料一般毒性較大，生物相容性差。熒光壽命長，典型的有機熒光染料的熒光壽命僅為幾納秒(ns)，這與很多樣本的自發(fā)熒光衰減的時間相當。而量子點的熒光壽命可持續(xù)長達數(shù)十納秒(20ns-50ns)，這使得當光激發(fā)數(shù)納秒以后，大多數(shù)的自發(fā)熒光背景已經(jīng)衰減，而量子點熒光仍然存在，此時即可獲得無背景干擾的熒光信號。圖量子點熒光仍然存在，此時即可獲得無背景干擾的熒光信號。圖1.量子點二、量子點的合成方法目前合成量子點的方法主要有兩種，一種是在有機體系中合成，即用金屬有機化合物在具有較強配位能力的有機溶劑中制備；另一種是在水溶液中直接合成。有機相合成法量子點最早采用膠體化學方法在有機體系中制備的方法，將金屬和有機化合物混合在有配位性質(zhì)的有機溶劑中，在一定的溫度條件下就能生長出納米晶體。這類方法制備的量子點分散性、穩(wěn)定性都較好，不容易聚沉，外表修飾容易。早期合成的量子點往往存在量子點粒徑分布較廣、熒光產(chǎn)率偏低等缺點。1993年，Bawendi及其同事用二甲基鎘和硒的三辛基膦〔TOP〕配合物作為前驅(qū)體，將其依次注入劇烈攪拌的三辛基氧化膦〔TOPO〕溶液中，合成了高熒光產(chǎn)率的CdSe

量子點，這種方法合成的量子點結晶性好、尺寸單分散、量子產(chǎn)率約為10%。這

一種突破，但當量子點制成水溶性時，其熒光產(chǎn)率會大大下列圖2.1996年,Hines

成功合成了ZnS包覆的CdSe量子點I.TI:MpH.liiieat il.linXrY^Ld4.Th— I.TI:MpH.liiieat il.linXrY^Ld4.Th— 國aEilx野mm.Finari:Xl-liKinz^EnrcnlIhcIid.<4￡cdIifkiurtd(1iHutidIiiifInuiuu*iMiiiduEdlb*、LIkifdJj>uipliuii^'Enr.iiK-fii??.r*kii|jihnm)種方法較以前來說是降。后來人們發(fā)現(xiàn)，當把ZnS或CdS包覆在CdSe納米晶體外表后，熒光產(chǎn)率會大大提高。1996年，Hines等就用二甲基鋅和六甲基二硅硫烷作為量子點殼層前驅(qū)體制備了CdSe/ZnS核殼式量子點，其量子熒光產(chǎn)率在室溫可達50%。但上述合成方法均采用(CH3)2Cd作為原料，而(CH3)2Cd的毒性很大，具有易燃、昂貴、室溫下不穩(wěn)定等特性；且當(CH3)2Cd注入熱的TOPO后，可能產(chǎn)生金屬沉淀，這些缺點限制了上述方法的推廣使用。2001年Peng等對以前的方法進行了改良，用毒性低平安友好的CdO代替原來有機相法中的劇毒原料二甲基鎘，在溫和的條件下制備了CdS包覆的CdSe量子點，并且其熒光量子產(chǎn)率可以到達50%以上。雖然有機相法合成的量子點有尺寸單分散，熒光量子產(chǎn)率高等優(yōu)點，但是因為油性量子點與生物環(huán)境不相容，并且制備方法不環(huán)保。如果要用在生物分析領域需要將油相量子點轉(zhuǎn)相為水溶性量子點。油相量子點經(jīng)過水溶性基團飾轉(zhuǎn)移到水相中后，其量子產(chǎn)率會降低，因而在生物分析領域的應用甚少。2.水相合成法目前，多利用水溶性巰基試劑作為穩(wěn)定劑直接在水相中合成量子點。巰基試劑對量子點的穩(wěn)定性及功能化起重要的作用，選擇帶有適當官能團的巰基化合物作為穩(wěn)定劑，對于控制量子點的外表電荷與外表特性極其重要，尤其當需要水溶性量子點做熒光標記時，穩(wěn)定劑的選擇就更為重要了。1994年，Vomeyer要將油相量子點轉(zhuǎn)相為水溶性量子點。油相量子點經(jīng)過水溶性基團飾轉(zhuǎn)移到水相中后，其量子產(chǎn)率會降低，因而在生物分析領域的應用甚少。2.水相合成法目前，多利用水溶性巰基試劑作為穩(wěn)定劑直接在水相中合成量子點。巰基試劑對量子點的穩(wěn)定性及功能化起重要的作用，選擇帶有適當官能團的巰基化合物作為穩(wěn)定劑，對于控制量子點的外表電荷與外表特性極其重要，尤其當需要水溶性量子點做熒光標記時，穩(wěn)定劑的選擇就更為重要了。1994年，Vomeyer提出用巰基為穩(wěn)定劑合成CdS。這是首次提出用巰基為穩(wěn)定劑合成量子點。1996年Rogach等用水相法成功合成了巰基乙醇和巰基甘油包覆的CdTe量子點，并得到了較高發(fā)光效率。1998年Gao等用巰基乙酸〔TGA〕作穩(wěn)定劑，制備出水溶性CdTe量子點。后來Zheng等首先采用水熱法在溫和條件下合成了水溶性CdTe量子點，大大縮短了水相法制備CdTe量子點的時間，其熒光量子產(chǎn)率也超過了30%。目前水熱法已經(jīng)成為直接用做生物熒光探針的量子點的主要合成方法。水相合成量子點CdTe的典型方法是首先將鎘鹽和巰基穩(wěn)定劑配成溶液，F(xiàn)ig.1.QD-nnicelleformationandcharacterization.(A)Schematicofsingle-QDencapsulalioninaphospholipidblcck-copolymermicelle.(E)TEMimageofQD-micellesdriedonacarbon-Formvar-coated200-meshnickelgrid.OnlytheQDsinsidethemiceLLecorearevisible.Theparticlesappearevenlyspreadonthesurface.AlthoughsomeclustersoftwotofourQDsarevisible,mostoftheQDsareisolated,suggestingthatamajorityofmicellescontainasingleQD.(C)TEMimagecfthephospholipidlayerobtainedbynegativestainingwith1%PTA(phosphotungstica<id|atpH7.Withthistechnique,boththeQDandthemicellecanbevisualizedatthewmetime.TheQD(darkspot)appearssurroundedby□wlhitediskofjn-^tainedphospholipidsthatstandsoutagainstthestainedbackground.AJECL100CXTEMvva?operatedat80kV.調(diào)節(jié)到適當?shù)膒H值，倒入三頸燒瓶中。碲氫化鈉前驅(qū)液的制備是通過硼氫化鈉復原碲粉反響而得到的，然后將碲氫化鈉倒入配好的鎘鹽和巰基穩(wěn)定劑的溶液中，形成CdTe單體，不斷的加熱，CdTe逐漸長大，通過控制加熱時間，可得到不同粒徑的量子點。水相合成量子點，不僅解決了量子點的水溶性問題，而且采用帶羧基、氨基等的巰基穩(wěn)定劑對其外表進行修飾，使得量子點能與生物分子上的氨基直接偶聯(lián)，因而可以直接用于生物醫(yī)學檢測。隨著水溶性量子點的性能不斷提高，良好的生物相容性的水溶性量子點有望成為新一代生物熒光探針。三、量子點在免疫層析技術中的應用量子點免疫層析技術利用量子點熒光探針做為標記物，不僅充分表達了免疫層析技術的簡便，快速，特異性強的優(yōu)點，而且展示了量子點的高靈敏度，以及它的熒光特性，顯示出巨大的開展?jié)摿蛷V闊的應用前景。目前深圳市金準生物醫(yī)學工程開發(fā)的量子點免疫熒光層析定量測試平臺----干式熒光免疫分析儀（KF-Q001-A〕是國內(nèi)首創(chuàng)。在此平臺上研發(fā)的降鈣素原〔PCT〕定量測定試劑盒一一量子點〔QD〕免疫熒光層析法也是國內(nèi)唯一一家成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化并取得注冊證號（粵械注準20212400386）的量子點診斷試劑。隨著開展和應用趨勢，越來越多的生物診斷試劑公司參加了量子點這個新興行業(yè)。與此同時，量子點免疫分析技術也在不斷地開展與改良，就其開展趨勢來看，主要有以下幾個方面：優(yōu)化量子點熒光探針的制備，得到熒光強度高的QDs，檢測信號會隨著QDs的熒光增強而大大提高。單獨的量子點顆粒容易受到雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，熒光量子產(chǎn)率很低，目前廣泛應用的是以QDs為核心，用另一種半導體材料包覆形成核殼結構后，如CdTe/ZnS，可將量子產(chǎn)率提高到約50%甚至更高，并在消光系數(shù)上有數(shù)倍的增加，因而有很強的熒光發(fā)射，可大大提高檢測靈敏度，有利于信號的檢測。實現(xiàn)定量檢測。至今已有局部實驗室或公司研制出QDs熒光定量的儀器，從而可以定量檢測出待測物的濃度，這將使量子點免疫層析技術得到更廣泛的應用，打破了傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術不能定量的限制。量子點的多色檢測。QDs其中一個優(yōu)點就是具有可精確調(diào)諧的發(fā)射波長?？梢酝ㄟ^調(diào)整粒子尺寸來得到不同發(fā)射的熒光QDs，無需改變粒子的組成和外表性質(zhì)。使得量子點可以用于多種組分的多