轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對草間黑白蛛生長發(fā)育及相關(guān)酶活性的影響

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對草間黑白蛛生長發(fā)育及相關(guān)酶活性的影響

在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，三個養(yǎng)分層的食物流和化學(xué)信息是結(jié)合在一起的。20世紀(jì)80年代以來,隨著化學(xué)生態(tài)學(xué)和行為生態(tài)學(xué)的發(fā)展,研究人員開始致力于植物、植食性昆蟲、天敵三重營養(yǎng)關(guān)系的研究。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)其中一營養(yǎng)層發(fā)生變化時,對其它營養(yǎng)層也會產(chǎn)生影響,因此外源基因的插入可能會通過改變作物某些物質(zhì)組分或含量,而影響害蟲的生長發(fā)育和繁殖等,最終導(dǎo)致天敵獵物質(zhì)量與數(shù)量的改變。環(huán)境安全性評價主要包括對生態(tài)系統(tǒng)中物種多樣性、生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、非靶標(biāo)生物生存與種群動態(tài)的影響以及靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性的風(fēng)險性等,因此,正確評價轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花對天敵的影響,對棉田害蟲的有效控制和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的合理應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。有關(guān)Bt水稻的環(huán)境安全評價已經(jīng)開展了一系列的研究,其中對非靶標(biāo)節(jié)肢動物影響的研究多集中在物種豐富度與多樣性、發(fā)育歷期、繁殖力、成蟲壽命和體重等方面。Lozzia等研究結(jié)果表明,用取食轉(zhuǎn)Bt玉米的稠李縊管蚜RhopalosiphumpadiLinnaeus飼喂草蛉,對草蛉幼蟲生長發(fā)育、死亡率無不利影響。草間小黑蛛ErigonidiumgraminicolumSundevall的雜食性使其在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用,棉花蕾盛期和花鈴盛期草間小黑蛛分別占全田蜘蛛群體總量的55.3%和60.4%,對棉蚜Aphisgossypii、紅蜘蛛Tetranychuscinnabarinus、紅鈴蟲Pectinophoragassypiella和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的初孵幼蟲等的捕食能力較強(qiáng),是農(nóng)田重要的天敵類群。而有關(guān)草間小黑蛛對轉(zhuǎn)基因棉田天敵的生物學(xué)特性和酶活性的影響尚未見報道。以往轉(zhuǎn)基因植物對天敵影響的安全性研究多涉及生物學(xué)和生態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定,既耗時、耗力,又較難標(biāo)準(zhǔn)化。如捕食性天敵的研究多集中在死亡率、生育時間、體重及體長等方面,而寄生性天敵的研究涉及100余個參數(shù),最常見的指標(biāo)有生育力、成蟲壽命、寄生的程度、體長、死亡率和幼蟲發(fā)育時間等。多數(shù)研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植物都對其有負(fù)面影響。本試驗采用酶聯(lián)免疫法和分光光度計法研究了2種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對草間小黑蛛生長發(fā)育和相關(guān)酶活性的影響,以期為轉(zhuǎn)基因棉花對天敵的風(fēng)險性評價尋求有效的檢測指標(biāo)。1材料和方法1.1試劑與試劑盒轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花品種2009002,簡稱雙價棉;轉(zhuǎn)Cry1Ac基因棉花品種中棉所45,簡稱單價棉;常規(guī)棉花品種中棉所49,簡稱常規(guī)棉,均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所遺傳育種研究室提供。在本所試驗農(nóng)場種植,每個品種種植666.7m2。膽堿酯酶活性試劑盒、溶菌酶試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒、過氧化物酶試劑盒、酸性磷酸酶試劑盒、氧化物歧化酶試劑盒、谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶試劑盒和過氧化氫酶試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。試蟲:棉鈴蟲試蟲為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所植物保護(hù)研究室棉花蟲害課題組常年在室內(nèi)飼養(yǎng)、不接觸任何化學(xué)農(nóng)藥的種群。1.2方法1.2.1紅酵母卵塊孵化試驗在棉花生長的蕾期進(jìn)行。采集不同棉花品種的上部嫩葉,飼喂初孵棉鈴蟲幼蟲24h后備用。從常規(guī)棉田采集草間小黑蛛的卵塊,室溫下孵化出幼蟲。試驗在20mm×100mm小試管中進(jìn)行,在常規(guī)棉棉葉上接入足夠量棉鈴蟲初孵幼蟲,每個試管中放置1頭草間小黑蛛,30管,重復(fù)3次。每天更換棉鈴蟲初孵幼蟲,調(diào)查記載天敵的生長發(fā)育、蛻皮情況,用十萬分之一的天平對初蛻皮后的草間小黑蛛分不同齡期稱重,直至所有供試草間小黑蛛生長發(fā)育至產(chǎn)卵為止。1.2.2凍存時間對體外源蛋白和酶活性的影響用常規(guī)棉、單價棉和雙價棉處理的棉鈴蟲幼蟲飼喂草間小黑蛛,當(dāng)其初變?yōu)?齡時,每處理隨機(jī)選擇15頭,液氮凍存,5頭作為1次重復(fù)用于體內(nèi)外源蛋白檢測和酶活性測定。外源蛋白檢測采用ELISA方法,酶活性測定按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。1.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析運用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,配對樣本采用雙尾t檢驗方法分析草間小黑蛛幼蟲歷期、體內(nèi)蛋白含量和酶活性的差異。2結(jié)果與分析2.1齡幼蟲發(fā)育歷期及發(fā)育情況與常規(guī)棉相比,取食飼喂單、雙價棉花嫩葉的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛,1~3齡幼蟲發(fā)育歷期差異均不顯著;4齡幼蟲發(fā)育歷期均延長,前者延長90.95%,差異極顯著(P<0.01),后者延長43.37%,差異顯著(P<0.05);5齡幼蟲發(fā)育歷期均延長,前者延長134.26%,差異極顯著(P<0.01),后者延長46.61%,差異顯著(P<0.05);取食單價棉花嫩葉飼喂的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛6齡幼蟲發(fā)育歷期與常規(guī)棉差異不顯著,但取食用雙價棉花飼喂的棉鈴蟲的草間小黑蛛發(fā)育到6齡后大量死亡(表1)。2.2棉鈴蟲幼蟲的草間小蛛類型分布與常規(guī)棉相比,取食飼喂2種轉(zhuǎn)基因棉花嫩葉的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛,除中棉所45處理的1齡幼蟲外,其余各齡期幼蟲體重均有所降低,但差異均不顯著(表2)。2.3蛛體內(nèi)外源蛋白的吸光值取食經(jīng)常規(guī)棉、單價棉和雙價棉嫩葉飼喂的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛體內(nèi)外源蛋白的吸光值分別為0.095、0.091和0.095,三者之間無顯著差異。說明用取食轉(zhuǎn)基因棉花嫩葉的棉鈴蟲幼蟲飼喂草間小黑蛛1個世代,草間小黑蛛體內(nèi)沒有外源蛋白的累積。2.4谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶活性與常規(guī)棉花相比,取食飼喂單、雙價棉花嫩葉的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛,6齡幼蟲的乙酰膽堿酯酶活性均有所升高,但差異不顯著;溶酶菌含量、堿性磷酸酶和氧化物歧化酶活性表現(xiàn)為前者降低,后者升高,但差異均未達(dá)顯著水平;酸性磷酸酶和過氧化氫酶活性表現(xiàn)為前者升高,后者降低,但差異均不顯著;谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶活性前者升高239.92%,后者升高195.57%,差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01);而與常規(guī)棉和雙價棉相比,取食飼喂單價棉花嫩葉的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛的過氧化物酶活性降低,差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)(表3)。3棉鈴蟲的配方優(yōu)化對棉間東北部干草間小蛛草間私家車內(nèi)的營養(yǎng)效應(yīng)的影響目前,關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對蜘蛛安全性評價的研究尚不夠深入,且多為對物種豐富度和種群數(shù)量影響的研究。Ludy&Lang研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花對蜘蛛生長發(fā)育無顯著影響。本試驗研究了3種不同類型棉花品種對草間小黑蛛幼蟲發(fā)育歷期的影響,與常規(guī)棉相比,取食飼喂單、雙價棉花嫩葉棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛,其低齡幼蟲的發(fā)育歷期無顯著的變化,這與郭建英等、董亮等的研究結(jié)果基本一致,但4齡和5齡幼蟲發(fā)育歷期差異達(dá)顯著或極顯著水平,取食單價棉花嫩葉飼喂的棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛6齡幼蟲發(fā)育歷期與常規(guī)棉差異不顯著,但取食用雙價棉花飼喂的棉鈴蟲的草間小黑蛛發(fā)育到6齡后大量死亡。與常規(guī)棉花相比,除中棉所45處理的1齡幼蟲外,取食飼喂單、雙價棉花嫩葉棉鈴蟲幼蟲的草間小黑蛛,其體重均有所降低,與Halcomb等、趙建周等的研究結(jié)果一致?？梢?經(jīng)轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花喂養(yǎng)的棉鈴蟲幼蟲飼喂的草間小黑蛛隨著齡期的增大,發(fā)育歷期和體重明顯延長和下降,且死亡率升高。究其原因可能有以下幾種:①轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花處理的棉鈴蟲幼蟲對草間小黑蛛的營養(yǎng)效應(yīng)影響較大,如相對代謝速率的加快,增加了幼蟲的代謝負(fù)擔(dān);②草間小黑蛛屬于雜食性昆蟲,轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花可溶性糖和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量較少且質(zhì)量較差,以其飼喂的棉鈴蟲來飼養(yǎng)草間小黑蛛,可能會由于棉鈴蟲體內(nèi)營養(yǎng)成分不足而導(dǎo)致草間小黑蛛攝取的營養(yǎng)單一,表現(xiàn)為忌食、驅(qū)避作用,其作用機(jī)制尚需深入研究。外源殺蟲基因的轉(zhuǎn)入使棉花體內(nèi)次生代謝物以及營養(yǎng)物質(zhì)含量發(fā)生改變。本試驗中,取食轉(zhuǎn)基因抗蟲棉葉片飼喂的棉鈴蟲的6齡草間小黑蛛體內(nèi)未檢測到外源蛋白的富集,表明轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中的Bt毒蛋白對捕食性天敵沒有影響。張永軍和郭予元研究結(jié)果顯示,當(dāng)瓢蟲、花蝽和普通草蛉Chrysopacarnea直接以轉(zhuǎn)Cry1Ab基因玉米的花粉為食時,含有Bt毒素的花粉對3種天敵成蟲存活率及成蟲數(shù)量無不利影響,與本試驗結(jié)果基本一致。超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶是昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶或解毒酶。已有研究表明,由于寄主植物不同,虎鳳蝶Papilioglaucus、棉蚜Aphisgossypii、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、煙蚜Myzuspersicae體內(nèi)的羧酸酯酶活性也不同。