聚羥基丁酸酯電紡絲膜的制備及體外降解行為

聚羥基丁酸酯電紡絲膜的制備及體外降解行為

電紡絲法制備納米纖維自20世紀(jì)90年代初首次人工組織皮膚出現(xiàn)以來，該組織的發(fā)展為患有組織壞死和缺陷的患者提供了希望。支架材料是組織工程研究中的一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn),它在組織和器官的修復(fù)過程中起著至關(guān)重要的作用,不僅為細(xì)胞提供了獲取營(yíng)養(yǎng)、氣體交換、生長(zhǎng)代謝的場(chǎng)所,而且還為組織的形成提供力學(xué)支撐。組織工程支架的制備方法有溶劑澆鑄-粒子瀝濾法、冷凍干燥法、發(fā)泡法等。但是這些方法都存在一定的局限性。近幾年,采用電紡絲方法制備組織工程支架的研究取得了很大進(jìn)展。電紡絲方法是在電場(chǎng)作用下的紡絲過程或利用高壓電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)的紡絲技術(shù),該方法最大的特點(diǎn)是不需要復(fù)雜的制備過程即可得到納米纖維。電紡絲法的缺點(diǎn)是產(chǎn)出低,因此限制了它的廣泛應(yīng)用。為此,2003年捷克利貝雷茨技術(shù)大學(xué)與Elmarco公司合作,研制出了可批量生產(chǎn)納米纖維的電紡絲機(jī)——“納米蜘蛛”,這標(biāo)志著電紡絲技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展階段。電紡絲技術(shù)對(duì)材料的要求不高,一般情況下可溶、熔的聚合物都可以紡絲,例如PLA、PEO、PA等。聚羥基丁酸酯(PHB)是一種源于微生物的熱塑性聚酯,它兼有天然降解材料和人工合成可降解材料的特點(diǎn),對(duì)它的研究主要集中在藥物緩釋和組織工程方面。近來,有學(xué)者采用電紡絲法制備PHB超細(xì)纖維,用作組織工程支架材料,但是對(duì)這種電紡絲支架的制備工藝、降解性能和生物相容性的研究還很有限。本研究采用電紡絲方法制備了聚羥基丁酸酯電紡絲膜支架,探討了各種操作參數(shù)對(duì)纖維形態(tài)的影響,并進(jìn)一步研究了它的降解性能和生物相容性。1材料和方法1.1不銹鋼接收屏電紡絲設(shè)備主要包括三個(gè)部分:高壓電源(DW-P303-1AC,Dongwen,China),恒壓注射泵(TS2-60,LongerCo.,China)和不銹鋼金屬接收屏(45mm×120mm)。聚羥基丁酸酯(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)、PHB、Mw≈30000g/mol,3HB含量為90.45mol%),由天津國(guó)韻生物技術(shù)有限公司提供。二氯甲烷(DM,分析純)、1,4-二氧六環(huán)(DO,分析純)購(gòu)于北京世紀(jì)紅星化工有限公司。1.2phb電紡絲膜的制備將一定量的PHB粒料溶于DM中,室溫下磁力攪拌24h,得到不同濃度的溶液(2wt%、3wt%、4wt%),作為電紡絲液。取5mL該溶液注入10mL連接4號(hào)醫(yī)用針頭的注射器中,并磨平針頭以防止紡絲過程中的尖端放電效應(yīng)。針頭末端與直流高壓電源連接。用導(dǎo)線將金屬接收屏與地相接,使其與針頭間形成電場(chǎng)?？刂坪銐罕昧魉?0.5mL/h、1mL/h、2mL/h、3mL/h、4mL/h)、接收距離(9cm、12cm、18cm、23cm)以及電壓(12kV)。制備得到厚度約為0.15mm的PHB電紡絲膜,作為組織工程支架。制備PHB澆鑄膜,并控制澆鑄膜的厚度與電紡絲膜相同,用以研究支架的各種物理化學(xué)性能。1.3樣條的降解考察PHB電紡絲膜及澆鑄膜在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中的體外降解行為。將電紡絲膜和澆鑄膜剪成2cm×1cm的矩形樣條,在50℃條件下真空干燥24h后,精確稱量所有的樣條。具體的降解過程如下:將樣條放入15mL的帶蓋玻璃瓶中,向瓶中加入10mLPBS緩沖溶液(pH7.4,0.2M)并完全浸沒樣條,然后置于37℃的恒溫烘箱中進(jìn)行降解。待樣條降解一定的周期(0d、7d、14d、21d、28d、42d)后,將其取出,用去離子水反復(fù)沖洗,干燥并稱重。每隔7d更換一次新鮮的PBS溶液。每組試驗(yàn)做3組平行試驗(yàn),取平均值。樣條的質(zhì)量損失率(WL)按如下方程來計(jì)算:WL=(M0?MtM0)×100%WL=(Μ0-ΜtΜ0)×100%式中,M0是樣條初始質(zhì)量,Mt是降解周期t(t=0d、7d、14d、21d、28d、42d)后樣條的質(zhì)量。1.4w、細(xì)胞培養(yǎng)為了分析PHB支架的生物相容性,將小鼠成纖維細(xì)胞(L929,北京積水潭醫(yī)院)接種于材料表面,觀察細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞(L929)復(fù)蘇2w,細(xì)胞傳代48~72h生長(zhǎng)旺盛時(shí)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。首先用紫外光消毒樣品,然后在24孔培養(yǎng)板中以細(xì)胞密度為4×104/孔接種在材料上。由于PHB支架的疏水性較強(qiáng),因此在接種細(xì)胞時(shí),先加少量細(xì)胞懸液于膜片上,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁1~2h。待細(xì)胞懸液基本滲入膜內(nèi)后,再補(bǔ)加培養(yǎng)基(1640,Gibco,USA)。繼續(xù)培養(yǎng)4d后,用3%的戊二醛溶液固定細(xì)胞0.5h,然后進(jìn)行SEM觀察。1.5纖維直徑和支架的結(jié)晶性對(duì)PHB支架進(jìn)行SEM(CambrigeS250MK3,UK)表征,根據(jù)SEM照片,測(cè)量纖維直徑。用XRD(D/max2500VB2+PC,RigakuCo.,Japan)分析支架的結(jié)晶性。用萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(Instron1185,USA)測(cè)試支架的力學(xué)性能,形變速率是100mm/min。2結(jié)果與討論2.1操作參數(shù)對(duì)phb纖維形態(tài)的影響2.1.1溶液濃度對(duì)電紡絲過程的影響在電紡絲過程中,溶液濃度對(duì)纖維形態(tài)起著至關(guān)重要的作用。從圖1中可以看出,當(dāng)溶液濃度為2wt%時(shí)PHB呈珠線體,大于2wt%時(shí)珠線體消失,得到了直徑較為均勻的纖維。隨著溶液濃度的增加,纖維的平均直徑也由2.02μm增加到2.23μm。在電紡絲過程中,聚合物射流經(jīng)歷三個(gè)不穩(wěn)定性,雷利不穩(wěn)定性(RayleighInstability),軸對(duì)稱不穩(wěn)定性(AxisymmetricalInstability)和彎曲不穩(wěn)定性(BendingInstability)。當(dāng)溶液濃度較低時(shí),溶液射流受到的雷利不穩(wěn)定性或軸對(duì)稱不穩(wěn)定性增大,易形成如圖1a中所示的珠線體。隨著溶液濃度的增大,珠線體的形成因素受到抑制,從而得到了形態(tài)良好的纖維。對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量、溶劑相同的聚合物溶液體系來說,其可紡濃度范圍是有限的,超出這個(gè)范圍,則電紡絲過程難以控制。因此,選擇一個(gè)合適的溶液濃度對(duì)于制備電紡絲膜來說很重要。另外,注射泵流速(紡絲溶液的補(bǔ)給速率)對(duì)纖維直徑的影響同溶液濃度一致,即纖維直徑隨注射泵流速的增加而增大(見圖2)。2.1.2彎曲不穩(wěn)定性作用于纖維圖3是接收距離(即噴絲口與接收屏間的垂直距離)對(duì)纖維直徑的影響。由圖3可知,隨著接收距離的增加,纖維直徑也隨之增大。在電紡絲過程中,彎曲不穩(wěn)定性對(duì)超細(xì)纖維的形成起著決定性的作用。具體地說,當(dāng)接收距離較近時(shí),射流受到的彎曲不穩(wěn)定性增強(qiáng),纖維的直徑變小;當(dāng)接收距離較大時(shí),射流受到的彎曲不穩(wěn)定性減弱,纖維的直徑增大。另外,當(dāng)電壓一定時(shí),電場(chǎng)強(qiáng)度與接收距離成反比,因此纖維直徑隨電場(chǎng)強(qiáng)度變化的趨勢(shì)與接收距離的規(guī)律相反。2.1.3phb/dm+do體系與傳統(tǒng)溶液紡絲相似,溶劑的性質(zhì)對(duì)電紡絲纖維的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與性能有很大影響。如圖4所示,對(duì)于PHB/DM體系,纖維直徑約0.89μm,纖維表面粗糙;對(duì)于PHB/(DM+DO)體系,直徑約1.4μm,纖維表面比較平滑且纖維界面間形成部分粘連。對(duì)于這一現(xiàn)象認(rèn)為:(1)DO的表面張力較大,能夠保證纖維表面的平滑;DO的沸點(diǎn)較高難以被完全除去,少量DO的存在促進(jìn)了聚合物分子鏈的松弛,從而導(dǎo)致了纖維界面間的粘連。因此溶劑體系對(duì)纖維形態(tài)的影響主要取決于溶劑的物理性質(zhì)及其與聚合物分子間的相互作用。2.2晶粒大小對(duì)結(jié)晶度的影響圖5是XRD譜圖,其中曲線a、b分別對(duì)應(yīng)PHB的電紡絲膜和澆鑄膜。相對(duì)于澆鑄膜,電紡絲膜晶面(020)的衍射峰強(qiáng)度更大,半峰寬更窄;相反地,(002)晶面上的衍射峰卻消失了。另外,由謝勒公式計(jì)算得出的電紡絲膜和澆鑄膜在垂直于(020)晶面的晶粒大小分別為22.3nm、18.1nm,即相對(duì)于澆鑄膜,電紡絲膜的晶粒較大。這些數(shù)據(jù)都說明PHB電紡絲膜在(020)晶面法線方向上的結(jié)晶速率遠(yuǎn)大于其他晶面,因此相應(yīng)的衍射峰也變得異常尖銳。研究發(fā)現(xiàn),如果聚合物纖維的拉伸速率與分子鏈松弛時(shí)間的乘積大于0.5,那么聚合物分子鏈可具有高度的取向。在電紡絲過程中,表面帶電的射流在彎曲不穩(wěn)定性的作用下其拉伸速率達(dá)到了105m/s,這個(gè)速率與聚合物鏈松弛時(shí)間(0.1~0.01s)的乘積遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.5,具備了分子鏈取向和結(jié)晶的理論條件。因此,可以確定PHB電紡絲膜的結(jié)晶度大于澆鑄膜。PHB電紡絲膜的這種取向結(jié)晶必將影響它的力學(xué)性能。2.3孔隙率對(duì)電紡絲膜力學(xué)性能的影響為了驗(yàn)證上面的推測(cè),對(duì)PHB電紡絲膜和澆鑄膜進(jìn)行了力學(xué)拉伸測(cè)試。如圖6所示,相對(duì)于澆鑄膜,PHB電紡絲膜的應(yīng)力、應(yīng)變較低。分析原因主要有以下兩點(diǎn):(1)較大的孔隙率降低了電紡絲膜的抗拉伸強(qiáng)度,在拉伸過程中,膜內(nèi)部大量孔洞的存在減小了樣條的承載面積,從而導(dǎo)致膜的拉伸強(qiáng)度下降;(2)電紡絲膜在凝固析出過程中各晶面法線上的結(jié)晶速率不同,如上所述在(020)晶面法線方向上形成較大的晶粒,它的力學(xué)表現(xiàn)是樣條斷裂伸長(zhǎng)率的下降?？傊?較大孔隙率和較高結(jié)晶度共同作用的結(jié)果,導(dǎo)致了電紡絲膜力學(xué)性能的下降。組織工程支架要具備一定的力學(xué)強(qiáng)度,如何提高電紡絲膜的力學(xué)強(qiáng)度有待進(jìn)一步研究。2.4phb膜的降解聚合物的降解過程受到很多因素的影響,包括聚合物性質(zhì)如成分、分子間相互作用、親/疏水性,結(jié)構(gòu)參數(shù)如外形、結(jié)晶度、取向程度、表面結(jié)構(gòu)等。電紡絲膜的特殊結(jié)構(gòu)不僅影響了它的結(jié)晶性及力學(xué)性能,而且在很大程度上也決定了其降解性能。如圖7所示,曲線a、b分別描繪了PHB電紡絲膜和澆鑄膜的質(zhì)量損失率(WL)同降解周期的關(guān)系。如圖所示,兩條曲線的變化趨勢(shì)相同,但降解速率不同:樣品降解42d后,電紡絲膜的WL是澆鑄膜的3倍。目前PHB可能的降解機(jī)制主要有兩個(gè):分子鏈無(wú)規(guī)斷裂機(jī)制和表面水解機(jī)制。Majid等研究了PHB澆鑄膜在有水和無(wú)水條件下的降解動(dòng)力學(xué),指出PHB在水溶液中的降解機(jī)制主要是表面水解。對(duì)于PHB電紡絲膜而言,其內(nèi)部含有大量的孔洞,這有利于PBS緩沖溶液的滲入和降解小分子的溶出;較大的比表面積有利于PHB纖維的表面水解;不對(duì)稱的結(jié)晶結(jié)構(gòu)進(jìn)一步促進(jìn)了表面水解的發(fā)生。因此,PHB電紡絲膜的加速降解歸因于它的特殊的表面結(jié)構(gòu)。對(duì)于組織工程支架而言,可控的降解速率是很重要的。因此,可以設(shè)想通過控制電紡絲膜的孔隙率、纖維直徑等能夠在一定范圍內(nèi)控制膜的降解速率。2.5phb電紡絲膜的微觀結(jié)構(gòu)選用小鼠成纖維細(xì)胞(L929)對(duì)PHB支架的生物相容性進(jìn)行了研究。如圖8所示,細(xì)胞在支架表面的形態(tài)各異,有的呈凸起狀(見圖8(a)),有的呈凹陷狀(見圖8(b)),有的則半嵌入支架中(見圖8(c))。細(xì)胞的這些形態(tài)與PHB電紡絲膜的微觀結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。PHB電紡絲膜是由纖維無(wú)規(guī)堆積而成,單個(gè)纖維的表面含有很多凹槽,表面粗超度較大,這有利于細(xì)胞與纖維表面的粘附,同時(shí)孔隙的存在利于細(xì)胞的新陳代謝、增殖分裂以及細(xì)胞間的信息傳遞。對(duì)PHB支架的細(xì)胞毒研究結(jié)果也表明該材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。因此PHB支架適宜細(xì)胞的生長(zhǎng),是一種具有較好生物相容性的支架材料。3phb支架的力學(xué)性能采用電紡絲法成功制備了聚羥基丁酸酯(PHB)支架,系統(tǒng)研究了支架的制備及性能。結(jié)果表明,紡絲液濃度、注射泵流速