槐米中蘆丁的提取及高純度鑒定

槐米中蘆丁的提取及高純度鑒定

蘆筍，也被稱為玉香茶，廣泛存在于植物界。目前發(fā)現(xiàn)的50多份植物含有蘆筍，其中蝗蟲和小麥的含量最高，可以提取大量蘆筍。蘆丁屬于黃酮類化合物,在心腦血管疾病的治療上起到了舉足輕重的作用,具有VP樣作用。有助于保持毛細血管正常彈性,同時還有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用。其臨床效果肯定,副作用少,同時也是一種植物原料藥。本實驗擬探究一種實驗室制備高純度蘆丁的方法,用作對照品或滿足其他特殊需要的試劑。1材料和機器1.1測試劑蘆丁標準品(中國藥品生物制品鑒定所),甲醇為色譜醇,其它試劑均為分析純,水為重蒸水。蘆丁購于延大醫(yī)附院藥房經(jīng)鑒定無誤。1.2色譜作業(yè)單位器日本島津高效液相色譜儀(LC10ATvp溶劑輸送泵,SPD10Avp紫外可見檢測器,CTO10Asp柱溫箱),HW2000色譜工作站(南京千譜軟件公司)。電子分析天平(型號BS124S),JB202-電熱恒溫干燥箱(上海金忠科學儀器有限公司制造),DL-360超聲波清洗皿(浙江象山縣石浦海天電子儀器廠),TGL-16臺式高速離心機(上海冠戈實業(yè)有限公司制造),紫外分光光度計(2401PC-日本島津)。2方法和結果2.1量飽和石灰水液微采用酸提堿沉法:稱取槐米粉,置500mL燒杯中,加沸水、硼砂攪拌,于石棉網(wǎng)上加熱至微沸,然后加入適量飽和石灰水溶液,保持pH8~9之間,并不斷地攪拌,微沸30min后,過濾,濾液收集。以同法再次收集濾液并合并,待濾液溫度降至60~70℃之間時用濃鹽酸調(diào)pH4~5之間,當溫度降至室溫時放入冰箱靜置12h,使沉淀完全,抽濾,沉淀,用蒸餾水洗至中性,干燥得粗品蘆丁,蒸餾水重結晶,得精制蘆丁。2.2葡聚糖凝膠柱頂聚酰胺膜的制備用葡聚糖凝膠柱進一步分離純化,稱取精制蘆丁0.25g,用少量甲醇使之溶解,加入葡聚糖凝膠柱頂,用甲醇洗脫,試管收集,15mL/管,共收集22管,用聚酰胺膜鑒定蘆丁并作如下合并收集液。第1瓶1~10管,第2瓶11~22管;然后水浴濃縮至原液的一半,冷置,僅第一瓶出現(xiàn)黃綠色微細針狀結晶,再繼續(xù)濃縮,60℃干燥即得蘆丁純品。2.3魯丁的鑒定2.3.1點管法點管法本品為黃色結晶粉末,熔程為188~190℃(梯勒熔點管法),鹽酸鎂粉反應呈陽性;氨性氯化鍶反應呈陽性顯示有鄰二酚羥基;鋯鹽枸櫞酸反應呈陽性顯示有3及5-羥基存在。水解液用薄層層析鑒定,顯示有葡萄糖及鼠李糖存在。2.3.2水、甲醇、醋酸乙酯甲醛用3cm×5cm的聚酰胺膜,選3種展開劑:分別為A,丙酮∶水(3∶1);B,氯仿∶甲醇(5∶4);C,醋酸乙酯∶甲酸∶水(8∶1∶1)。氨熏后噴顯色劑3%的三氯化鋁顯色,經(jīng)重結晶的蘆丁樣品在上述3種展開劑中均只顯一個斑點。2.3.3氫磁共振法的發(fā)現(xiàn)蘆丁樣品與蘆丁標準品圖一致。2.4測定了石膏含量hplc法2.4.1對照品及樣品流動相為甲醇4.3%乙酸(55∶45),應用前經(jīng)混合纖維素酯微孔濾膜過濾,超聲脫氣,流速為1.0mL/min,進樣量為20μl,檢測波長為254nm,蘆丁的出峰時間為3~4min,該色譜條件下對照品及樣品的色譜一致。2.4.2紫外分光光度計檢測配置蘆丁標準品溶液濃度為0.002.04mg/mL在紫外分光光度計中掃描,結果顯示最大吸收波長有214、254、360nm,由于在214nm處干擾因素多,因此高效液相選擇在254nm處測定。2.4.3樣品2號的制備精密稱取經(jīng)變色硅膠干燥的蘆丁標準品0.01005g,蘆丁樣品1號(為經(jīng)過葡聚糖凝膠柱分離的)0.01005g,蘆丁樣品2號(未經(jīng)葡聚糖凝膠柱分離的)0.01002g,分別置于50mL容量瓶內(nèi),用甲醇定容,在超聲清洗皿中超聲3min,使之全部溶解,然后在分別倒少量入EP管中離心10min,12000r/min。得蘆丁標準品溶液濃度為0.201mg/mL,蘆樣1號濃度為0.2001mg/mL,蘆樣2號濃度為0.2004mg/mL。2.4.4標準曲線的繪制蘆丁標準品溶液的濃度為0.2001mg/mL,將其稀釋成1,1/2,1/4,1/16,1/64,1/256系列濃度,編號為1,2,3,4,5,6,吸取20μl進樣,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線如下,進行線性回歸處理,求出回歸方程:Y=4E+07X-2660.2,r=0.9996,濃度單位是mg/mL,峰面積的范圍在228710.5μV·s~7494036.5μV·s內(nèi)。結果表明蘆丁的濃度在0.00628125~0.201mg/mL范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關系。2.4.5樣品的質(zhì)量分析將配制好的蘆丁樣品1號,2號進樣,測得峰面積,然后代入標準曲線得濃度。測得樣品的含量為98.05%。2.4.6標準品溶液的測定分別取3份已知濃度的樣品1號溶液0.8mL放入EP管中,在分別加標準品溶液0.1,0.2,0.3mL,甲醇0.2,0.1,0mL,定于1.1mL,離心10min,12000r/min,結果見附表。2.4.7試驗的精密度精密量取蘆丁樣品1號溶液1mL放入EP管中,離心10min,12000r/min.供試品5次測量結果RSD%為0.33,小于2.0%,說明本試驗的精密度較好。2.4.8甲醇離心時間的確定精密量取蘆丁樣品1號溶液0.8mL于EP管中,在加0.2mL甲醇,分別做5份,離心10min,12000r/min。RSD%0.44,小于2.0%,說明本實驗的重現(xiàn)性較好。3葡聚糖凝膠分離黃酮類化合物用酸提堿沉法提取蘆丁具有工藝簡單、效率高和較經(jīng)濟等優(yōu)點,采用高效液相法測定蘆丁的含量,該法使用的試劑常見,方法精確、靈敏、線性范圍寬,穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能滿足要求。測得蘆丁的含量為98.05%,可以代替對照品測定物質(zhì)的含量和滿足其它特殊需要的試劑。在蘆丁的提取工藝中,由于用的是酸提堿沉法,所以加入的石灰水的量和濃鹽酸的量是本試驗的關鍵,當pH為10時,產(chǎn)品質(zhì)量為1.5g,當pH為9時,產(chǎn)品質(zhì)量為2.3g,當pH為8時,產(chǎn)品質(zhì)量為1.97g,當pH為7時,產(chǎn)品質(zhì)量為1.10g。葡聚糖凝膠對分離黃酮類化合物效果很好,此方法即簡便,又適合實驗室操作。實驗產(chǎn)品純度高,含量達98.05%,可代替蘆丁標準品測定蘆丁制劑中的蘆丁含量。實驗中筆者發(fā)現(xiàn)蘆丁極易被氧化變色,要注意避光干燥保存。選擇沸水溶液提取以破壞酶,