流感病毒分離鑒定

流感病毒分離鑒定

流感病毒的突變是快速發(fā)生的。人們通常很容易感受到這種感覺。如果它在短時間內(nèi)大量傳播，將對人類健康構(gòu)成威脅。加強流感監(jiān)測工作,及時發(fā)現(xiàn)流感病毒的變異,為有效應(yīng)對流感爆發(fā)或大流行提供科學(xué)依據(jù),2012年5月新疆克孜勒蘇柯爾克孜自治州(簡稱克州)疾病預(yù)防控制中心流感網(wǎng)絡(luò)實驗室開展了流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)的初步應(yīng)用,結(jié)果報告如下。1材料和方法1.1流感病患者作為流感學(xué)樣本經(jīng)克州疾病預(yù)防控制中心流感網(wǎng)絡(luò)實驗室實時PCR檢測陽性(4例為新甲型H1N1,10例為乙型流感)的14份流感患者咽拭子樣本。采集好的咽拭子,立即放入含病毒采樣液的病毒采樣管內(nèi),震搖后置于-70℃冰箱保存待檢。1.2免疫組化產(chǎn)品狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心傳染病防治科配發(fā),克州疾病預(yù)防控制中心流感病毒分離實驗室液氮罐中凍存。所用鑒定血清和抗原均由中國疾病預(yù)防控制中心流感中心配發(fā)。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、HEPES、0.25%EDTA-胰酶、TPCK胰酶均使用新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心傳染病防治科統(tǒng)一配發(fā)美國進口產(chǎn)品,均在有效期內(nèi)使用。雙抗(青霉素、鏈霉素)使用國產(chǎn)有效期內(nèi)產(chǎn)品。細(xì)胞生長液、細(xì)胞維持液、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、1ml無菌移液管、10ml無菌移液管、15ml無菌離心管、無菌T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔U型微量血凝板、移液器及吸頭等。1.31%人o型紅細(xì)胞由克州中心血站提供,所用紅細(xì)胞用PBS連續(xù)洗3遍,配制成1%人O型紅細(xì)胞懸液,放入4℃冰箱待用。1.4mdck細(xì)胞接種的準(zhǔn)備和接種MDCK細(xì)胞生長液、細(xì)胞維持液嚴(yán)格按自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心傳染病防治科流感網(wǎng)絡(luò)實驗室提供的標(biāo)準(zhǔn)配方配制,并以NaHCO3溶液調(diào)pH7.2～7.4。液氮罐中凍存的MDCK細(xì)胞復(fù)蘇,MDCK細(xì)胞培養(yǎng)成75%～90%成片細(xì)胞T25細(xì)胞瓶的準(zhǔn)備,流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離方法,紅細(xì)胞凝集試驗(HA),紅細(xì)胞血凝抑制試驗(HI)均按自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心傳染病防治科流感網(wǎng)絡(luò)實驗室提供的標(biāo)準(zhǔn)方法和標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)CO2培養(yǎng)箱溫度為37℃、5%CO2。MDCK細(xì)胞標(biāo)本接種后培養(yǎng)溫度為33℃。MDCK細(xì)胞75%～95%成片細(xì)胞的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶準(zhǔn)備:MDCK細(xì)胞培養(yǎng)2～3d后,將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)生長情況,當(dāng)MDCK細(xì)胞平鋪底部75%～95%,即可用于標(biāo)本的接種。MDCK細(xì)胞標(biāo)本接種后33℃培養(yǎng)7～10d,當(dāng)75%～100%MDCK細(xì)胞出現(xiàn)病變時進行收獲,收獲病毒上清液測定血凝效價。樣本第一代紅細(xì)胞凝集試驗陰性,可用收獲的全部上清液盲傳,盲傳兩代后仍為陰性則棄之。2結(jié)果2.1病毒分離和鑒定流感病毒能夠與豚鼠、雞紅細(xì)胞或人O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集,檢測流感病毒及其病毒滴度就是根據(jù)這一特性而進行的。試驗使用1%人O型紅細(xì)胞懸液,并作陰性對照。經(jīng)紅細(xì)胞凝集試驗14份標(biāo)本中,病毒分離物血凝HA滴度≥1∶32的有4號、6號、10號標(biāo)本,病毒分離陽性。其余11份標(biāo)本血凝HA滴度均<1∶4,盲傳兩代HA滴度仍均<1∶4棄之。2.2血凝抑制試驗(HI)鑒定流感病毒型別使用已處理好4個血凝單位的流感新甲型H1N1、乙型Yamagata系(BY)、乙型Victoria系(BV)標(biāo)準(zhǔn)血清,1%人O型紅細(xì)胞懸液,將HA滴度≥1∶32的4號、6號、10號陽性標(biāo)本病毒培養(yǎng)分離物用血凝抑制試驗(HI)試驗進行鑒定。4號標(biāo)本新甲型H1N1陰性,BY為1∶8,BV為1∶128。6號標(biāo)本新甲型H1N1陰性,BY為1∶4,BV為1∶128。10號標(biāo)本新甲型H1N1陰性,BY為1∶4,BV為1∶128。分離出的3株病毒鑒定結(jié)果均為B型流感病毒,與本實驗室實時PCR檢測結(jié)果相符,見表1。3流感病毒mdck細(xì)胞培養(yǎng)分離積累經(jīng)驗的總結(jié)在標(biāo)本中分離到病毒是診斷病毒感染的“金指標(biāo)”。狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)是目前用于流感病毒分離培養(yǎng)最常用的敏感細(xì)胞系,克州疾病預(yù)防控制中心流感實驗室應(yīng)用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法分離流感病毒,可同時提供大量的、重復(fù)性好的、生物學(xué)性狀相似的MDCK細(xì)胞用于病毒分離,經(jīng)濟方便,病毒分離陽性率高,可長期開展流感病毒監(jiān)測工作。目前新疆地(州)級疾病預(yù)防控制中心均已開展流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù),但部分地(州)至今未能成功分離出流感病毒。流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)的初步應(yīng)用在克州疾病預(yù)防控制中心首獲成功,成功分離出流感病毒,為今后流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)分離積累經(jīng)驗,為流感監(jiān)測提供科學(xué)技術(shù)支持。由于流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)操作較復(fù)雜,MDCK細(xì)胞嬌嫩、易污染,對檢驗人員和實驗條件的要求高。本次流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離實驗,是用經(jīng)本實驗室實時PCR檢測流感陽性的14份流感患者咽拭子樣本進行MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離流感病毒,主要是為以后的流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離積累經(jīng)驗。本次試驗體會如下:(1)使用凍存的MDCK細(xì)胞種子控制在10代以內(nèi)。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)2～3d后,細(xì)胞已平鋪底部75%～95%的對數(shù)生長期接種病毒,有利于流感病毒的復(fù)制。(2)用于流感病毒MDCK細(xì)胞培養(yǎng)分離的標(biāo)本應(yīng)使用新鮮標(biāo)本,盡快分離病毒。48h內(nèi)分離的可以保存在4℃,超過48h-70℃凍存,盡快分離,避免反復(fù)凍融。(3)收獲病毒之前可以將細(xì)胞放于-70℃冰箱,凍融1～2次,以提高收獲標(biāo)本的病毒滴度。(4)每個標(biāo)本應(yīng)平行接種2瓶,以便流感病毒分離陽性時,有足夠的收獲標(biāo)本量上報國家流感實驗室。(5)流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)分離實驗整個過程一定要無菌操作。培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液營養(yǎng)豐富,培養(yǎng)細(xì)胞的過程中易發(fā)生微生物污染,操作須在生物安全柜內(nèi)進行,培養(yǎng)液需添加抗生素預(yù)防和控制微生物污染的發(fā)生。(6)要用新鮮的人“O”型血配制1%的紅細(xì)胞懸液,配制必須標(biāo)準(zhǔn)化,每次使用時要混勻。(7)稀釋液被細(xì)菌污染或血清受細(xì)菌污染變質(zhì)時對紅細(xì)胞凝集抑制試驗結(jié)果產(chǎn)生很大影響。(8)HI實驗須新鮮準(zhǔn)確配制4u/25μl的抗原,應(yīng)進行紅細(xì)