氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中藥材中的14種農(nóng)藥殘留

氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中藥材中的14種農(nóng)藥殘留

中醫(yī)藥一直是預(yù)防和治療中國人民疾病的重要工具，在保障中國人民健康和中華民族繁榮方面發(fā)揮了重要作用。近年來,隨著一些安全事件的爆發(fā),食品、藥品安全問題越來越引起人們的重視,農(nóng)藥殘留問題就是其中之一。農(nóng)藥殘留問題更在一定程度上影響著我國中藥材產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化和國際化［１］。參考其他國家標(biāo)準(zhǔn),新版《歐洲藥典》制訂了70多項(xiàng)涉及105種農(nóng)藥的最大殘留限量(maximumresiduelimit,MRL)［２］?！睹绹幍洹?、《英國藥典》和日本《肯定列表制度》也分別規(guī)定了藥材中上百種農(nóng)藥最大殘留限度標(biāo)準(zhǔn)［３－５］。我國2010年版《中國藥典》只規(guī)定了9種有機(jī)氯農(nóng)藥、12種有機(jī)磷農(nóng)藥、3種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)方法［６］,而且在限量標(biāo)準(zhǔn)方面僅規(guī)定了甘草和黃芪兩種藥物的六六六、滴滴涕、五氯硝基苯的限量標(biāo)準(zhǔn),其他中藥材尚未涉及［７］,這與其他國家的標(biāo)準(zhǔn)有較大差距。同時(shí)我國食品標(biāo)準(zhǔn)中農(nóng)藥殘留檢測(cè)品種達(dá)500余種,相比之下,中藥材中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)品種少,前處理方法落后,靈敏度和專屬性也存在一定的問題,易產(chǎn)生假陽性和假陰性的結(jié)果［１］。因此建立中藥材農(nóng)藥多殘留的檢測(cè)新方法十分必要。目前檢測(cè)中藥材中農(nóng)藥殘留的研究中,多采用氣相色譜(GC)［８］、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)［９］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)［１０］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)［１１］。利用GC或GC-MS進(jìn)行農(nóng)藥多殘留的檢測(cè),很多農(nóng)藥不易分開,而且易出現(xiàn)假陽性的情況。相對(duì)于一級(jí)質(zhì)譜,二級(jí)質(zhì)譜抗干擾能力強(qiáng),可以實(shí)現(xiàn)幾百種農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)。QuEChERS方法是由美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務(wù)中心開發(fā)的一種快速、簡便、價(jià)格低廉、環(huán)境友好的預(yù)處理方法,是實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模樣品處理較理想方法,有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前,采用QuECh-ERS方法主要有3種方式:未加緩沖鹽的原創(chuàng)QuEChERS方法［１２］、加乙酸鹽緩沖液的美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AssociationofOfficialAnalyticalChem-ists,AOAC)標(biāo)準(zhǔn)方法［１３］以及加入檸檬酸鹽以獲得穩(wěn)定pH的EN15662方法［１４］。QuEChERS方法應(yīng)用于農(nóng)藥多殘留檢測(cè)過程中,對(duì)于酸堿度敏感的農(nóng)藥,一般需要用緩沖溶液來減少因pH值的波動(dòng)引起的農(nóng)藥(如異菌脲,克菌丹,苯線磷等)的降解,從而得到滿意的回收率。2011年,Xu等［８］應(yīng)用乙酸-乙酸鈉作為緩沖溶液測(cè)定中藥材中的多農(nóng)藥殘留。2008年,Lehotay等［１５］利用檸檬酸二鈉鹽和檸檬酸三鈉鹽為緩沖溶液測(cè)定水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留。本文以QuEChERS作為樣品前處理方法,考察了不同提取溶劑、凈化劑、緩沖溶劑等對(duì)添加回收率的影響,探究了144種農(nóng)藥的GC-MS/MS測(cè)定方法,對(duì)人參、西洋參、黃芪、當(dāng)歸、金銀花、枸杞、茯苓、牡丹皮、甘草、白術(shù)、枇杷葉等11種中藥材中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了篩查測(cè)定,取得了滿意的結(jié)果。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)用超純水材料TraceGCUltra氣相色譜儀、TSQQuantumGC三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher公司),配AI/AS3000自動(dòng)進(jìn)樣器;電子天平TE612-L(德國Sartorius公司);高速冷凍離心機(jī)D-78532(德國Hettich公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-1100(日本EYELA公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。乙腈、正己烷(色譜純,美國ThermoFisher公司);丙酮、甲苯、乙酸乙酯(色譜純,美國J.T.Bak-er公司);氯化鈉、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、乙酸(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑、碳十八(C18E)吸附劑、中性氧化鋁(Alumina-N)、氨基(CleanertNH２)填料、石墨化炭黑(GCB)填料(中國AgelaTechnologies公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)制成的超純水;150種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于90%,德國Dr.Ehren-storfer公司)。1.2工作儲(chǔ)備液各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱取一定量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品,置于5mL的小燒杯中,用甲苯溶解后轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中,用甲苯定容,配制成約為1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-18℃貯存?zhèn)溆??；旌瞎ぷ鲀?chǔ)備液:分別取一定量的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100mL容量瓶中,用甲苯稀釋定容,配制成混合工作儲(chǔ)備液,各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度均為2.0mg/L,儲(chǔ)存在-18.0℃冰箱中備用。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別取2.5、5.0、25.0、50.0、75.0、100.0、250.0、500.0μL的混合工作儲(chǔ)備液,用甲苯定容到1mL,配制成5.0、10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、500.0、1000.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。1.3試驗(yàn)條件1.3.1urevaporization,ptv色譜柱:AgilentTechnologiesDB-5MS(30m×0.25mm,0.25μm)。程序升溫氣化(pro-grammed-temperaturevaporization,PTV):初始溫度70.0℃,以14.5℃/s速率升溫到330.0℃,保持2min。PTV后清洗程序:以14.5℃/s速率降溫到200.0℃,保持1.0min。柱溫箱程序升溫:初始溫度80.0℃,保持0.5min后以18.0℃/min升至150.0℃,保持0.5min;然后以4.0℃/min升至260.0℃;最后以15.0℃/min升至300.0℃,保持5min。載氣:氦氣(純度99.999%)。恒流模式:1.2mL/min。進(jìn)樣量:1.0μL。1.3.2溫度4.0.2%傳輸線溫度5.電離模式:電子轟擊(EI);轟擊能量:70eV;燈絲電流:60μA;離子源溫度:250.0℃;傳輸線溫度:300.0℃;碰撞氣:氬氣(純度99.999%);溶劑延遲時(shí)間:4.5min;掃描方式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。144種農(nóng)藥保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)見表1。Xcalibur2.1工作站用于儀器控制和數(shù)據(jù)處理。1.4超聲提取法根據(jù)SN/T1957-2007［１６］的要求將樣品粉碎,并過2.0mm篩。隨后稱取5.00g上述樣品,置于50mL具塞塑料離心管中,加入15.0mL水浸潤樣品,靜置15min。然后加入20.0mL含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的乙酸的乙腈溶液、4.00g氯化鈉、0.20g無水乙酸鈉,漩渦混勻2min,超聲提取30min。再以6000r/min的速率離心8min,取4.0mL上清液于雞心瓶中,于30℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。向其中加入2.0mL甲苯復(fù)溶,取1.5mL溶液置于2.0mL凈化離心管中,管內(nèi)預(yù)先裝有200mgPSA、200mgC18、150mg無水硫酸鎂和適量GCB,振蕩漩渦2min,然后以6000r/min的速率離心5min,取上清液過0.22μm的有機(jī)相濾膜,濾液供GC-MS/MS檢測(cè)。2結(jié)果與討論2.1目標(biāo)分析化合物的選擇本文依據(jù)《中國藥典》(2010版)、《歐洲藥典7.0》、《日本肯定列表制度》藥草部分、《美國藥典34》等藥典涉及的農(nóng)藥目錄,結(jié)合我國常用于中藥材種植中的農(nóng)藥種類,選擇了150種作為目標(biāo)分析化合物。在實(shí)驗(yàn)過程中剔除了基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重、響應(yīng)值不高、定量效果差的農(nóng)藥辛硫磷、吡蟲啉、氯酯磺草胺,剔除了在一定溫度下能降解生成敵敵畏的敵百蟲和高溫易分解的農(nóng)藥敵菌丹、異丙威,最終確定了144種農(nóng)藥目標(biāo)物。2.2色譜條件的確定以Xcalibur2.1工作軟件的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(SRM)為掃描方式。根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間把掃描分為7個(gè)掃描窗口,使每個(gè)時(shí)間段的掃描離子對(duì)數(shù)量適中,調(diào)整離子對(duì)掃描時(shí)間(scantime),保證每個(gè)目標(biāo)化合物色譜峰的采集點(diǎn)數(shù)量在15個(gè)點(diǎn)左右,并且響應(yīng)值滿足要求。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。2.3與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液比較基質(zhì)效應(yīng)是在分析復(fù)雜基質(zhì)農(nóng)藥殘留時(shí)需要考慮的一個(gè)重要問題。與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法不同,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的基質(zhì)效應(yīng)以增強(qiáng)為主。Erney等［１７］經(jīng)過研究分析了兩類易產(chǎn)生基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)的化合物,一類是在汽化溫度下熱不穩(wěn)定的化合物,一類是樣品進(jìn)入色譜柱或檢測(cè)器時(shí)易被吸附的化合物。通過與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液比較,可以說明基質(zhì)誘導(dǎo)響應(yīng)增強(qiáng)的農(nóng)藥回收率增高是由于基質(zhì)的保護(hù)作用,因?yàn)榧內(nèi)軇┎荒転榇治鲛r(nóng)藥提供足夠的保護(hù),所以純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際響應(yīng)值低于其本應(yīng)該產(chǎn)生的值。而在空白基質(zhì)溶液中添加相同濃度的農(nóng)藥,可使農(nóng)藥更加完全地轉(zhuǎn)移到色譜柱中,從而響應(yīng)增加,在這個(gè)過程中基質(zhì)起到了分析保護(hù)作用?；|(zhì)效應(yīng)可以用基質(zhì)效應(yīng)因子(matrixfactor,MF)來表示,MF=X/Y×100%。X為純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的平均響應(yīng)值,Y為空白樣品基質(zhì)中添加相同含量的農(nóng)藥的平均響應(yīng)值。以人參為例發(fā)現(xiàn),基質(zhì)效應(yīng)明顯增強(qiáng)(MF>150%)的農(nóng)藥有克菌丹、三唑酮、二嗪農(nóng)、稻豐散;基質(zhì)效應(yīng)呈明顯減弱趨勢(shì)(MF<70%)的有乙酰甲胺磷和稻瘟酰胺;有138種化合物的MF在70%~150%之間。由于同一目標(biāo)物在不同基質(zhì)中所受的基質(zhì)效應(yīng)的大小不同,因此可以使用對(duì)應(yīng)的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行校正,一定程度上減弱了基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物的影響。2.4提取溶劑的選擇及用量范圍的確定目標(biāo)化合物包括有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯類等多種農(nóng)藥,而且復(fù)雜中藥材基質(zhì)含糖量高并含有氨基酸、多種活性成分和揮發(fā)性物質(zhì),所以要求提取溶劑對(duì)農(nóng)藥有足夠的溶解性和一定的選擇性。本實(shí)驗(yàn)比較了6種常用提取溶劑:乙腈、丙酮、乙腈-丙酮(1∶1,v/v)、乙酸乙酯、正己烷、正己烷-丙酮(4∶1,v/v)。通過比較提取液的顏色,測(cè)試不同提取溶液的背景干擾情況,以樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)為指標(biāo),綜合考察提取溶劑的提取效果。從提取液顏色觀察,由深到淺分別是丙酮>乙腈-丙酮(1∶1,v/v)>乙腈>正己烷-丙酮(4∶1,v/v)>乙酸乙酯>正己烷。說明丙酮對(duì)色素類雜質(zhì)提取多,不適用于顏色深的樣品。采用不同提取溶劑對(duì)144種農(nóng)藥進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)。由圖1看出回收率(n=4)滿足要求的有乙腈-丙酮(1∶1,v/v)、丙酮、乙酸乙酯和乙腈。圖2為添加回收率試驗(yàn)滿足要求的4種提取溶劑提取空白人參基質(zhì)得到的初級(jí)萃取液全掃模式(fullscanmode)的總離子流圖(TIC)。從圖2可看出,乙腈提取中藥材中的雜質(zhì)明顯少于其他溶劑,其次是乙酸乙酯。綜合上述分析,乙腈和乙酸乙酯是兩種效果較好的提取溶劑。參考Lehotay等［１５］和Beyer等［１８］的研究發(fā)現(xiàn),乙酸乙酯提取液經(jīng)過凈化后含有更多的基質(zhì)物質(zhì)不是因?yàn)樵诔跆崛≈刑崛×烁嗟幕|(zhì)物質(zhì),而是在凈化過程中乙酸乙酯提取液中的基質(zhì)物質(zhì)更不易被凈化,導(dǎo)致基質(zhì)物質(zhì)殘留量比乙腈的多。乙腈作提取溶劑同時(shí)還具有以下優(yōu)點(diǎn):在鹽飽和的狀態(tài)下可以與水完全分離而不需要引入非極性溶劑;應(yīng)用于氣相色譜分析有很好的適用性。故本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。2.5回收率的測(cè)定本文考察了乙腈在下列3種條件下提取樣品的方法:方法一是直接用乙腈提取,方法二是加入乙酸鹽緩沖溶液條件下提取,方法三是加入檸檬酸鹽緩沖溶液提取;其中方法二和方法三調(diào)節(jié)pH在5.0~6.0之間。如表2所示,方法一的回收率明顯低于方法二和方法三。比較方法二和三,發(fā)現(xiàn)方法二的回收率略高于方法三,但差異不明顯。在實(shí)際操作過程中,乙酸鹽緩沖液體系(pH5.0~6.0)的抗基質(zhì)自身酸堿度干擾的能力強(qiáng),適合于多種中藥基質(zhì)。參考Lehotay等［１５］的方法,本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸鹽緩沖溶液作為提取的緩沖體系。根據(jù)文獻(xiàn)［１９，２０］,在QuEChERS中,以乙酸-乙酸鈉的比例(1mL乙酸/10g乙酸鈉)可使樣品提取液處于pH約為5.5的平衡緩沖狀態(tài)。AOAC方法中乙酸用量是提取溶劑的1%(v/v),而乙酸為揮發(fā)酸,用量高會(huì)對(duì)進(jìn)樣口、色譜柱等儀器部分有一定的腐蝕破壞。因此本文中考察了兩個(gè)乙酸添加水平(0.20mL乙酸+2.00g乙酸鈉和0.02mL乙酸+0.20g乙酸鈉)下提取樣品對(duì)144種農(nóng)藥回收率的影響,在人參中的試驗(yàn)結(jié)果見表3?？梢妰蓚€(gè)添加水平下的提取效率相近。但考慮到乙酸對(duì)整個(gè)儀器的影響,本實(shí)驗(yàn)選擇用量較少的0.02mL乙酸+0.20g乙酸銨組合作為緩沖體系。2.6凈化吸附劑的選擇和用量2.6.1凈化液的選擇AOAC2007.01方法使用PSA主要去除糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類和親脂性色素等極性物質(zhì),C18是QuEChERS最為重要的凈化劑。Lehotay等和Koesukwiwat等的研究表明,C18和PSA的實(shí)際應(yīng)用范圍廣,相對(duì)于弗羅里硅土(Florisil)和中性氧化鋁(Al2O3-N),C18和PSA對(duì)農(nóng)藥的回收率影響很小,但對(duì)色素的凈化效果均不理想。GCB主要去除色素等物質(zhì),但因其在多殘留農(nóng)藥的檢測(cè)中會(huì)導(dǎo)致回收率的下降,在無顏色或者淺顏色的基質(zhì)中應(yīng)盡量避免使用。本文選擇淺顏色的人參主要考察了幾種凈化劑組合(PSA(300mg)、PSA(150mg)+C18(150mg)、PSA(150mg)+Al2O3-N(150mg)、PSA(150mg)+Florisil(150mg)、C18(300mg))的凈化效果。從凈化液的顏色方面觀察,由淺到深的分別是:PSA、PSA+Florisil、PSA+Al2O3-N、PSA+C18、C18,但相差不明顯。圖3是5種凈化劑組合凈化人參基質(zhì)后凈化溶液的全掃描TIC圖的重疊比較。觀察PSA+C18譜線的基線明顯低于其他組合,而且噪聲峰少,因此本實(shí)驗(yàn)選擇PSA+C18作為人參等無顏色或者淺顏色的凈化劑,而當(dāng)歸、枇杷葉等提取液較深的中藥材需加入適量GCB。2.6.2psa和c8用量的優(yōu)化因?yàn)橹兴幉幕|(zhì)復(fù)雜,因此在不影響農(nóng)藥回收率的基礎(chǔ)上,可適量增加凈化劑的用量以保證樣品的凈化效果。(1)PSA用量的優(yōu)化:分別取PSA50、100、150、200、250mg,比較其用量對(duì)回收率的影響。如圖4所示,隨著PSA用量的增加,回收率也隨之變好,但250mg的用量反而降低了回收率。雖然150mg和200mg的用量均能滿足回收率的要求(70%~120%)［２２］,但200mg的凈化效果更好,本實(shí)驗(yàn)選擇PSA的用量為200mg。(2)C18用量的優(yōu)化:比較C18用量分別為50、100、150、200、250mg對(duì)農(nóng)藥回收率的影響。由圖4可知C18用量為150mg和200mg時(shí),目標(biāo)物的回收率均能滿足要求。但200mg用量的凈化效果更好,本實(shí)驗(yàn)選擇C18的用量為200mg。(3)GCB用量的優(yōu)化:GCB的用量應(yīng)根據(jù)萃取液的顏色深淺來選擇。以當(dāng)歸為例,GCB用量大于10mg時(shí),隨著GCB的用量增加,農(nóng)藥回收率呈下降趨勢(shì)(見圖5)。考慮到凈化效果和農(nóng)藥回收率的雙重因素,本實(shí)驗(yàn)選擇GCB的用量為10mg。2.7回收率的測(cè)定按照樣品前處理方法的步驟做基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,在5~2000μg/kg之間選擇10個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn):5、20、50、100、150、200、500、1000、1500、2000μg/kg分別進(jìn)樣檢測(cè),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;以S/N=10確定定量限(LOQ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)(r２)均大于0.983;在人參基質(zhì)中,除了乙酰甲胺磷、滅蟲威、西瑪津、克菌丹、異狄氏劑、異菌脲的線性范圍是30~2000μg/kg,甲萘威、氧化樂果、喹硫磷、艾氏劑、烯丙菊酯、滅菌丹、硫丹、除盡、咪酰胺、雙甲脒的線性范圍是20~2000μg/kg,其余目標(biāo)物的都為10~2000μg/kg;目標(biāo)物的LOQ都小于殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(表略),可以滿足中藥材中這些農(nóng)藥殘留的分析要求。本文采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液-外標(biāo)法定量,在11種中藥材中添加144種混合農(nóng)藥進(jìn)行回收率試驗(yàn),并用人參、西洋參、當(dāng)歸和黃芪空白基質(zhì)分別制成20、50、200μg/kg的低、中、高不同水平的加標(biāo)樣品溶液,按1.3和1.4節(jié)進(jìn)行前處理和測(cè)定,每個(gè)水平重復(fù)4次。在人參基質(zhì)中,除了乙酰甲胺磷、艾氏劑和雙甲脒回收率偏低(乙酰甲胺磷73.4%~88.2%,艾氏劑73.1%~88.9%,雙甲脒72.0%~