外定向自我剪接機(jī)制的結(jié)果分析和驗(yàn)證一種DNA片斷體外定向自我剪接機(jī)制的結(jié)果分析和驗(yàn)證

第一部分文獻(xiàn)綜述1.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與分類限制性核酸內(nèi)切酶是識(shí)別生物體中特定DNA堿基序列并在該區(qū)域切割雙鏈DNA序列的核酸內(nèi)切酶[1-3]。目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶都來源于細(xì)菌。它們?cè)诩?xì)菌中的生物學(xué)功能主要是通過切割入侵的外源DNA序列，防止異源DNA無法有效轉(zhuǎn)錄(例如噬菌體)，從而使外源DNA序列(生命體)失去生命力，但不會(huì)破壞細(xì)菌本身DNA的原始遺傳信息，形成細(xì)菌體內(nèi)一種天然的免疫防御機(jī)制。1.1.1限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)Arber[4](1962)在研究大腸桿菌時(shí)，提出細(xì)胞內(nèi)限制和修飾作用的模型假說：一是可以識(shí)別DNA堿基序列的限制酶,另一個(gè)則是可以識(shí)別與相應(yīng)的限制酶相同的堿基序列的修飾酶，Yuan和Meselson(1968)證實(shí)了這一假設(shè)。Arber等(1968)首次從大腸桿菌B株細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶。Smith等(1970)發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌(H-aemo-philusinfluenzaed)可以在不降解自身DNA情況下降解侵入細(xì)菌體內(nèi)的噬菌體DNA；通過純化DNA水解酶，確定了其高度特異性識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，并將其命名為HindⅡ，這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，HindⅡ酶切后的DNA片段可以重組，這種限制性內(nèi)切酶逐漸成為研究基因組成、表達(dá)及功能的重要工具。限制性內(nèi)切酶廣泛存在于原核生物中。通過對(duì)原核生物基因組進(jìn)行測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)許多可編碼限制性內(nèi)切酶的基因，因而發(fā)現(xiàn)更多種類的限制性內(nèi)切酶。在1980年代初期，通過克隆技術(shù)將限制性核酸內(nèi)切酶基因進(jìn)行異位表達(dá)，避免其原始細(xì)胞中其他核酸內(nèi)切酶的污染，并提高了限制性內(nèi)切酶的純度和產(chǎn)量，其純化過程也不斷優(yōu)化。1.1.2限制性內(nèi)切酶的分類根據(jù)切割位點(diǎn)識(shí)別序列之間的距離差異、激活因子的差異以及它們是否同時(shí)具有甲基化酶活性，可將限制性內(nèi)切酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大類(圖1A、B)[5]?；谙拗菩詢?nèi)切酶的切割特征可分為兩種類型：非特異性切割位點(diǎn)和特異性識(shí)別的核苷酸序列(僅特定序列可被切割)?？梢蕴禺愋宰R(shí)別的切割位點(diǎn)應(yīng)具有回文序列，即在切割位點(diǎn)，沿一條鏈的正向讀取的堿基序列與另一條鏈的反向讀取的序列相同。又根據(jù)限制性內(nèi)切酶在特定切割部位的不同切割方法，可分為位錯(cuò)切割和平面切割。位錯(cuò)切割是指切割兩條DNA鏈的不同部分，中間被幾個(gè)核苷酸隔開，切割末端形成類似回文結(jié)構(gòu)的單鏈末端，該末端與具有互補(bǔ)堿基的靶基因片段相連，因此稱為粘性末端，如BamHI等。平面切割指切割兩條鏈特定序列的相同部分，切割后形成具有非粘性末端的平口，且切割部位位于回文序列的中間以形成平整末端，如SamI。圖1三種限制性內(nèi)切酶的特性及切割雙鏈DNA示意圖(A)三種限制性內(nèi)切酶的特性；(B)三種限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA示意圖。Fig.1Characteristicsofthreekindsofrestrictionendonucleasesandschematicdemonstrationofdigestingdouble-strandDNAbythem(A)Characteristicsofthreerestrictionendonucleases;(B)Schematicdemonstrationof3kindsofrestrictionendonucleasesdigestingdouble-strandDNA.1.2限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用由于限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA分子有特定的切割能力，因而自發(fā)現(xiàn)Ⅱ型限制性內(nèi)切酶以來，成為人們?cè)诜肿铀缴锨懈钅康腄NA片斷和分析遺傳信息的重要工具。1.2.1限制性內(nèi)切酶在染色體DNA分析中的應(yīng)用用限制酶將DNA切割成一系列片段，通過瓊脂糖凝膠電泳將上訴一系列片段分離開，通過遷移速度或在電子顯微鏡下觀察各種片斷的大小。這些片段在整個(gè)基因組中的順序主要由幾種不同的限制性酶決定，這些酶部分水解DNA，然后通過電泳分析產(chǎn)物。DNA中每個(gè)脫氧核苷酸的順序分析也可用相同的方式進(jìn)行。1.2.2限制性內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶可特異性地識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列，并通過切割雙鏈DNA中每條鏈上的磷酸二酯鍵來斷裂DNA。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要切割DNA。但是，在自然情況下，生物體內(nèi)限制酶通常不切割自身DNA分子，僅切割外源DNA。目前已經(jīng)從原核生物中分離出多種限制性內(nèi)切酶，且已商業(yè)化并廣泛用于基因工程中，已成為重要的切割工具，是基礎(chǔ)克隆中最重要的工具酶之一，是重組技術(shù)和基因診斷中的一類重要酶。其應(yīng)用范圍包括構(gòu)建DNA基因物理圖譜、DNA堿基序列分析、基因定位和分離、相關(guān)的DNA分子比較等。限制性內(nèi)切酶的廣泛使用使得基因工程技術(shù)得到飛速發(fā)展。1.3基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù)主要利用一種人工設(shè)計(jì)和修飾的核酸酶，在基因組水平上對(duì)靶基因進(jìn)行定向切割，以實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除和定向置換的最終效果[6-8]。其作用機(jī)理是修飾的序列特異性核酸酶可以錨定到基因組的靶序列位點(diǎn)，從而切割靶DNA序列產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double-strandbreak,DSB)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)非同源末端連接(Non-homologousendjoining,NHEJ)，這就導(dǎo)致基因組中堿基的插入和缺失。除了NHEJ修復(fù)外，如果在基因編輯過程中同時(shí)引入外源性目標(biāo)基因的同源序列，以及同源重組(Homologousrecombination,HR)啟動(dòng)導(dǎo)入序列與目標(biāo)序列之間的修復(fù)，可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的突變修復(fù)或產(chǎn)生定點(diǎn)插入和替換、基因疊加突變[9,7-8]?；蚓庉嫾夹g(shù)發(fā)展過程中先后出現(xiàn)三代系統(tǒng)，即鋅指蛋白核酸酶(Zincfingernucleases,ZFNs)[10-11]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALENs)[12-13]和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat,CRISPR)[14-15]。ZFN和TALEN都是人工融合蛋白，包含一個(gè)融合到限制性內(nèi)切酶FokI的非特異性核酸酶功能域的DNA結(jié)合域。ZFN和TALEN已經(jīng)成功地應(yīng)用于許多生物，包括植物[16-17]。2013年以來，基因編輯主要利用CRISPR/Cas9及其改良技術(shù)手段，最近又出現(xiàn)CRISPR/Cas變體Cas12a(Cpf1)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)基于RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶，可靶向基因組中大部分靶位點(diǎn)。它高效、精確地定向編輯基因組，即雙鏈DNA分子特異性切割，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂，然后激活同源重組的修復(fù)機(jī)制或易錯(cuò)的非同源末端修復(fù)機(jī)制以實(shí)現(xiàn)基因編輯[18]。與Cas9一樣，Cpf1也是由RNA引導(dǎo)的核酸酶，但其識(shí)別的PAM是T富集區(qū)。另外，Cpf1可能會(huì)在PAM的遠(yuǎn)端導(dǎo)致交錯(cuò)的雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生粘性缺口。該蛋白的發(fā)現(xiàn)豐富了CRISPR系統(tǒng)并擴(kuò)大了其在基因編輯中的應(yīng)用。1.3.1鋅指核酸酶技術(shù)(ZFNs)ZFNs是一種人工重組的核酸內(nèi)切酶，由鋅指蛋白DNA結(jié)合酶和非特異性核酸內(nèi)切酶FokI構(gòu)成[19-21]，它是21世紀(jì)初開發(fā)的第一代基因編輯技術(shù)[22]。ZFNs的第一個(gè)成分是鋅指蛋白，在真核細(xì)胞中很常見，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)相互作用[23]。ZFNs的第二個(gè)組成部分是FokInuclease。FokI是在黃桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制性酶，由DNA識(shí)別和切割結(jié)構(gòu)域組成[24]。FokI僅在形成二聚體時(shí)才能切割DNA[25]，因此ZFNs進(jìn)行基因編輯需要結(jié)合至DNA頂部和底部鏈的兩個(gè)單體才能誘導(dǎo)DSB。Wright等(2005)取得重要突破，他們率先使用ZFN進(jìn)行植物細(xì)胞基因編輯，證明ZFN可以用于植物基因打靶；通過利用煙草原生質(zhì)體中有缺陷的選擇標(biāo)記基因的恢復(fù)，他們證明與隨機(jī)整合相比，基因打靶頻率最多可提高10-1[26]。同時(shí)，Lloyd等人(2005)證明了ZFNs可以通過NHEJ來突變擬南芥基因組中人工引入的限制性位點(diǎn)[27]。2009年，Wright等和陶氏化學(xué)公司獨(dú)立證明，DSB誘導(dǎo)的HR可以利用ZFNs修飾煙草和玉米的內(nèi)源基因[28-29]。在玉米中，ZFN介導(dǎo)玉米IPK1基因的基因打靶是以重組IPK1的表達(dá)產(chǎn)生抗除草劑表型的方式獲得。結(jié)果表明基因打靶的頻率非常高，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中均達(dá)到10%以上[29]。1.3.2轉(zhuǎn)錄激活因子核酸酶基因編輯技術(shù)(TALEN)TALEN系統(tǒng)中關(guān)鍵因子是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白(TALEs)，是在革蘭氏陰性植物病原體(如Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)的一類新型的DNA結(jié)合蛋白[30-31]。Bonas等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌病原體Xanthomonas將TALEs傳遞到給宿主[32]。且該蛋白質(zhì)帶有與各種植物啟動(dòng)子結(jié)合的DNA結(jié)合域[13,33-34]。DNA結(jié)合域由一系列不同數(shù)量的重復(fù)單元組成，每個(gè)重復(fù)單元由33-35個(gè)高度保守的氨基酸殘基組成，僅第12、13位的氨基酸具有不同的重復(fù)序列，且單體存在差異，該位點(diǎn)稱為重復(fù)可變雙氨基酸殘基(Repeatvariablediresidues,RVD)，它們負(fù)責(zé)DNA特異性識(shí)別。由于每個(gè)RVD識(shí)別不同的DNA堿基，例如，NI識(shí)別A、HD識(shí)別C、NG識(shí)別T和NN識(shí)別G，因此，RVD的差異也就決定了TALE對(duì)DNA識(shí)別的特異性[12,35-36]。TALEN系統(tǒng)由包含核定位信號(hào)的N末端結(jié)構(gòu)域，識(shí)別特定DNA序列的中央結(jié)構(gòu)域和具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C末端結(jié)構(gòu)域組成。與ZFN相似，TALEN通過TALE元件與DNA序列特異性結(jié)合，F(xiàn)okI切割形成DSB，特定序列的轉(zhuǎn)化由NHEJ或HR完成。研究表明，TALENs在植物基因工程中具有很好的潛在用途[37-38]。Li等通過TALEN介導(dǎo)將突變基因?qū)胨綩sSWEET14基因的啟動(dòng)子已證明基于病原體的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序被破壞，這導(dǎo)致水稻抗病性的增強(qiáng)[39]。Wright等利用TALENs在多達(dá)30%的轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體中引入ALS基因的靶向突變[26]。同時(shí)，Wright等[26]還利用供體模板在煙草中進(jìn)行了TALEN介導(dǎo)的基因打靶實(shí)驗(yàn)，該供體模板在ALS和YFP標(biāo)記基因之間產(chǎn)生了基因融合。這使得利用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定YFP熒光定量的基因打靶效率成為可能。且基因打靶的頻率高達(dá)14%。最近，TALENs也已被用于短孢子蟲[40]和大麥[41]中進(jìn)行定向編輯。1.3.3規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)/效應(yīng)蛋白(CRISPR系統(tǒng))CRISPR技術(shù)最早于1987年在大腸桿菌K12iap基因側(cè)翼序列中被發(fā)現(xiàn)[42]，2002年被命名為串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)[43]。Cas9蛋白與單向?qū)NA(Single-guideRNA,sgRNA)結(jié)合不僅具有識(shí)別功能，而且還具有切割功能。由于Cas9獨(dú)特的RNA-DNA識(shí)別機(jī)制，靶向特定位點(diǎn)變得簡(jiǎn)單，尤其是在同時(shí)編輯多個(gè)靶標(biāo)時(shí)，CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)與ZFNs和TALENs前兩代技術(shù)相比，操作步驟大大簡(jiǎn)化，編輯效率顯著提高[44]。此外，在CRISPR-Cas9基礎(chǔ)上還開發(fā)出多種基因編輯技術(shù)，將切割活性缺失型的Cas9與其他效應(yīng)蛋白結(jié)合在一起進(jìn)行基因定位、激活、抑制甚至定點(diǎn)誘變[45-48]。ZetscheB等(2015)發(fā)現(xiàn)CRISPR家族Type2V成員Cpf1不僅具有良好的DNA靶向切割活性[49]，而且還具有與CRISPR-Cas9顯著不同的編輯特性[49-55]。Cpf1識(shí)別的PAM(protospacer-adjacentmotif)序列富含T，與Cas9識(shí)別的NGGPAM互補(bǔ)，大大擴(kuò)展了第三代基因編輯技術(shù)的應(yīng)用范圍。就突變類型而言，與傾向于形成單個(gè)堿基插入缺失(Indel)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)不同，CRISPR-Cpf1編輯系統(tǒng)傾向于產(chǎn)生幾個(gè)堿基甚至大片段的缺失。以上兩種CRISPR編輯系統(tǒng)已迅速應(yīng)用于多個(gè)物種。1.4CRISPR/Cas9系統(tǒng)1.4.1CRISPR/Cas9的發(fā)現(xiàn)及分類CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌進(jìn)化出的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，用于失活入侵的外來病毒和DNA中的基因功能。CRISPR/Cas主要由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成。其中，CRISPR是“簇規(guī)則間隔短回文序列”的縮寫形式，由29bp的重復(fù)序列和32-33bp的非重復(fù)序列組成，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，由短而高度保守的前導(dǎo)序列，重復(fù)序列和間隔子組成[56]；而Cas則代表的是CRISPRRNA(crRNA)結(jié)合蛋白，具有切割DNA序列的能力[43]。CRISPR/Cas系統(tǒng)包含I-VI等6種類型[57]。I型系統(tǒng)的特征蛋白Cas3含有用于降解靶標(biāo)的DNase和解旋酶結(jié)構(gòu)域，III型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特征蛋白Cas10則具有RNase的活性[58]。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)包含Cas1、Cas2、Cas9和第4個(gè)成員Csn2或Cas4。其中，Cas9是II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的標(biāo)志性基因，其編碼的蛋白質(zhì)除了在crRNA生物合成中起作用，同時(shí)在切割外源DNA方面也起著至關(guān)重要的作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由crRNA，反式激活crRNA(tracrRNA)和Cas9蛋白等3部分組成[59]。1.4.2CRISPR/Cas9的機(jī)制CRISPR/Cas9由于其簡(jiǎn)單性、多功能性和專一性，已成為研究基因功能和改善農(nóng)作物的重要生物技術(shù)工具[60]。Cas9具有RuvC和His-Asn-His(HNH)兩個(gè)DNA切割結(jié)構(gòu)域，其斷裂的雙鏈DNA(double-strandedDNA,dsDNA)位點(diǎn)主要位于PAM序列上游3bp處[61]。HNH結(jié)構(gòu)域切割crRNA的互補(bǔ)鏈，而RuvC樣結(jié)構(gòu)域切割dsDNA的相反鏈[62]。因此，CRISPR/Cas9使用易錯(cuò)的NHEJ或HR機(jī)制在體內(nèi)修復(fù)DNA。NHEJ通常會(huì)導(dǎo)致DNA在切割位置隨機(jī)插入缺失，而HR通過在預(yù)測(cè)的DSB位點(diǎn)添加具有序列同源性的供體DNA模板來實(shí)現(xiàn)供體序列(donorfragment)插入或基因替換[61]。Cas9與crRNA和tracrRNA建立核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)復(fù)合物來有效地切割DNA。crRNA在匹配和識(shí)別靶標(biāo)DNA中起至關(guān)重要的作用。它包含一個(gè)序列，該序列通過與靶DNA的堿基配對(duì)將Cas9RNP引導(dǎo)至特定基因座，形成一個(gè)R環(huán)。R環(huán)的形成激活了HNH和RuvC樣核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，分別用于切割DNA的靶鏈和非靶鏈，形成DSB[63]。tRNA與募集到復(fù)合物中的crRNA和Cas9蛋白結(jié)合[64]。gRNA是由tRNA和crRNA組成的嵌合分子，由一個(gè)18-20-nt間隔序列與PAM附近的靶DNA互補(bǔ)而形成。PAM是一個(gè)3-nt(NGG)序列，位于sgRNA目標(biāo)位點(diǎn)的下游，在和Cas9結(jié)合介導(dǎo)的DNA切割中起著至關(guān)重要的作用[65]。因此，CRISPR/Cas9基因編輯分三步進(jìn)行：(1)核定位Cas9蛋白的表達(dá)；(2)生成含有20-nt與靶基因互補(bǔ)的gRNA；(3)需要NGGPAM位點(diǎn)識(shí)別，且該位點(diǎn)必須位于靶位點(diǎn)3’末端附近。在sgRNA的指導(dǎo)下，sgRNA和Cas9在基因組中搜索靶標(biāo)，并在PAM位點(diǎn)上游約3bp處產(chǎn)生平末端DSB[66]。1.4.3CRISPR/Cas9的應(yīng)用CRISPR/Cas9具有不同的識(shí)別位點(diǎn)，可同時(shí)編輯多個(gè)位點(diǎn)而無需二聚化。Cas9蛋白有與FokI酶相似的功能，具有高基因編輯效率，低細(xì)胞毒性以及對(duì)靶位點(diǎn)精確編輯，靶位點(diǎn)外不會(huì)發(fā)生基因突變，還具有易操作和穩(wěn)定遺傳優(yōu)勢(shì)[67]。CRISPR/Cas9技術(shù)已廣泛用于編輯多種植物功能基因，包括擬南芥[68]、水稻[69]、玉米[70]、大豆[71]、高粱[72]、棉花(陸地棉)[73-74]、番茄[75]和馬鈴薯[76]等。在擬南芥原生質(zhì)體中，基于NHEJ的靶向編輯效率高達(dá)5.6%，而在煙草細(xì)胞中高達(dá)38.5%[77]。2015年，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的大豆基因組編輯首次取得成功[78]；李東昊等(2017)使用CRISPR系統(tǒng)同時(shí)編輯水稻系統(tǒng)中8個(gè)功能基因，證明CRISPR系統(tǒng)可以同時(shí)靶向并敲除多個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)編輯[79]。Li等使用CRISPR/Cas9編輯棉花GhMYB25-likeA和GhMYB25-likeD基因，兩個(gè)基因靶點(diǎn)的編輯效率分別是14.2%至21.4%[80]。1.5CRISPR/Cas12a(Cpf1)1.5.1CRISPR/Cpf1的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)CRISPR/Cas12a(Cpf1)屬于II類CRISPR系統(tǒng)，由RNA引導(dǎo)。該系統(tǒng)主要由弗朗西斯氏菌屬(Francisella)的FnCpf1，氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)的AsCpf1和毛螺菌科(Lachnospiraceae)的LbCpf1組成，3者均具有DNA核酸內(nèi)切酶活性。其中FnCpf1與CRISPR/Cas9類似，但表現(xiàn)出一些獨(dú)特的特征[49]。Cpf1由單個(gè)crRNA引導(dǎo)，并利用富含T的PAM序列切割靶標(biāo)dsDNA[49]。Cas9切割DNA產(chǎn)生平末端，Cpf1在PAM的遠(yuǎn)端位置生成末端交錯(cuò)的DSB，這可能具有一定的優(yōu)勢(shì)，尤其是在進(jìn)行基因功能敲入時(shí)，可能會(huì)提高基于NHEJ機(jī)制的敲入效率[81]。1.5.2CRISPR/Cpf1作用原理Cas9利用HNH和RuvC核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域分別切割目標(biāo)和非目標(biāo)DNA鏈[82]。而Cpf1由一個(gè)RuvC核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可切割DNA的Nuc結(jié)構(gòu)域組成[83]，并以Nuc域替換了Cas9切割的DNA鏈的HNH核酶域[84-85,83]。另有報(bào)道，Cpf1可作為一種將前體crRNA剪切為成熟crRNA的RNase[86]，并已被用于處理植物中基因編輯的crRNA陣列[87]，這些特征提高了Cpf1切割位點(diǎn)的插入效率[88]。由crRNA引導(dǎo)的Cpf1與特定PAM附近的DNA靶序列結(jié)合，催化DNADSB，激活細(xì)胞內(nèi)NHEJ或HR修復(fù)機(jī)制，并實(shí)現(xiàn)諸如基因敲除、插入和替換的編輯效果[84,89-91,83,92-93]。與Cas9在PAM位點(diǎn)附近引入雙鏈斷裂并產(chǎn)生平末端不同[82]，Cpf1切割PAM位點(diǎn)遠(yuǎn)端的DNA并產(chǎn)生5-nt粘性末端[49]。這一特性使Cpf1成為有效的體外DNA拼接的工具，并基于Cpf1消化和T4DNA連接酶介導(dǎo)連接建立DNA拼接標(biāo)準(zhǔn)，即C-Brick[94]。值得注意的是，C-Brick標(biāo)準(zhǔn)既能識(shí)別長(zhǎng)DNA序列，又能在部分之間產(chǎn)生短疤痕，具有廣泛的應(yīng)用潛力。為進(jìn)一步探索Cpf1識(shí)別和剪切RNA和DNA的機(jī)制，研究者從相關(guān)結(jié)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行了分析，并比較了其與Cas9的異同。Dong等[95]分析了LbCpf1-crRNA二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，表明該復(fù)合物為雙葉結(jié)構(gòu)，具有三角形外觀，且復(fù)合物中央帶有帶正電的通道。與以擴(kuò)展構(gòu)象結(jié)合Cas9的sgRNA不同，crRNA是高度失真的構(gòu)象，一旦被Cpf1蛋白中間的寡聚核苷酸結(jié)合域(oligonucleotidebindingdomain,OBD)識(shí)別，就會(huì)導(dǎo)致Cpf1的松散構(gòu)象形成緊湊的三角結(jié)構(gòu)。此時(shí)，位于蛋白質(zhì)中心的帶正電荷的通道可以接受crRNA和靶序列形成的異源雙鏈體，從而促進(jìn)下一步反應(yīng)的進(jìn)行。據(jù)推測(cè)，OBD的環(huán)狀螺旋(looped-outhelicaldomain,LHD)結(jié)構(gòu)域與識(shí)別雙鏈DNA底物的PAM序列有關(guān)。Stella等[84]確定了三鏈R環(huán)(“R”莖環(huán))結(jié)構(gòu)，對(duì)明確FnCpf1準(zhǔn)確識(shí)別靶DNA序列等相關(guān)分子機(jī)制具有重要的意義。1.5.3CRISPR/Cpf1的編輯特點(diǎn)與Cas9的機(jī)制和結(jié)構(gòu)特征不同，Cpf1不僅在基因編輯中具有更好的切割活性和更高的特異性，而且在多基因編輯中也具有更顯著的優(yōu)勢(shì)。1.5.3.1用于切割目標(biāo)DNA的CRISPR/Cpf1位點(diǎn)與Cas9使用RuvC和HNH結(jié)構(gòu)域進(jìn)行平末端切割不同，Cpf1則用RuvC和Nuc結(jié)構(gòu)域?qū)蠨NA的第23位互補(bǔ)鏈和第18位非互補(bǔ)鏈作為靶標(biāo)，以產(chǎn)生交錯(cuò)的切割粘性末端[95]。除了切割靶DNA的互補(bǔ)鏈外，Lei等[96]還增加了Cpf1的切割特性。不僅靶標(biāo)DNA的互補(bǔ)鏈的23位被切割，而且非互補(bǔ)鏈的第18位也被切割，并且在非互補(bǔ)鏈的14至18位形成多個(gè)切割位點(diǎn)。此外，還發(fā)現(xiàn)Cpf1的切割位點(diǎn)受crRNA間隔子序列長(zhǎng)度的影響。當(dāng)間隔序列的長(zhǎng)度大于或等于20時(shí)，Cpf1傾向于切割非互補(bǔ)鏈的第18位；當(dāng)間隔子序列長(zhǎng)度小于20時(shí)，Cpf1傾向于切割非互補(bǔ)鏈的14位。此特性有助于插入新的DNA序列，并使Cpf1更有效地激活HR[93]。同時(shí)，Cpf1能在較短間隔子長(zhǎng)度的crRNA介導(dǎo)下特異性切割靶DNA的第14與22位，形成8-nt長(zhǎng)黏性末端的特征，結(jié)合具有高精度連接特性的TaqDNA連接酶，將其開發(fā)為體外無縫編輯大型DNA片段的新工具。15.3.2CRISPR/Cpf1對(duì)PAM選擇范圍Cas9蛋白傾向于含G的PAM序列，而5'-NGG-3'PAM在選擇CRISPR-Cas靶序列中的作用非常有限。相反，16種Cpf1家族蛋白都顯示出對(duì)富含胸腺嘧啶的PAM的選擇偏好性[49,97-98]。TuM等[91]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)nCpf1對(duì)PAM序列的識(shí)別可以延長(zhǎng)到5'-KYTV-3'。因此，Cpf1的應(yīng)用開發(fā)使基因編輯的選擇范圍擴(kuò)大，尤其是它編輯富含嘧啶的PAM的靶位點(diǎn)更具優(yōu)勢(shì)。1.5.3.3CRISPR-Cpf1的特異性Cpf1不僅具有更好的切割活性，同時(shí)也具有更高的特異性。體外實(shí)驗(yàn)中，Kleinstiver等[99]使用GUIDE-seq分析來比較AsCpf1、LbCpf1與SpCas9的脫靶條件。大多數(shù)脫靶位點(diǎn)中，Cpf1插入缺失的頻率小于0.1％。與SpCas9相比，Cpf1幾乎沒有脫靶的現(xiàn)象，對(duì)基因編輯特別是基因治療來說更重要[90,99,100]。1.5.3.4CRISPR/Cpf1對(duì)多基因的編輯Cpf1豐富了CRISPR家族，Cpf1又以其獨(dú)特的編輯功能成為Cas9技術(shù)的重要補(bǔ)充?；蚪M功能研究、遺傳育種和其他過程中需要多基因突變體，因此使用CRISPR技術(shù)對(duì)多基因進(jìn)行編輯非常重要。盡管已經(jīng)報(bào)道Cas9可用于多基因編輯，例如核糖核酸酶和Cas9共表達(dá)策略以及轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和導(dǎo)向RNA策略的組合[101-103]，但這些策略在設(shè)計(jì)、成本或經(jīng)濟(jì)上仍然不方便，限制了Cas9在多基因編輯中的應(yīng)用。Cpf1則在很大程度上彌補(bǔ)了Cas9在多基因編輯中的缺點(diǎn)。而且與Cas9相比，Cpf1在多基因編輯中具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)Cas9切割DNA需要兩個(gè)小RNA分子，而Cpf1只需一個(gè)RNA分子；(2)Cas9切割可形成平末端，而Cpf1形成粘性末端，粘性末端比平末端更易于操作；(3)Cpf1切割距離識(shí)別位點(diǎn)較遠(yuǎn)，選擇范圍較寬；(4)Cpf1可以識(shí)別連續(xù)2或3胸腺嘧啶(T)的PAM序列，從而擴(kuò)展基因編輯范圍；(5)Cpf1除了能對(duì)DNA切割外，同時(shí)也能對(duì)RNA切割，有利于構(gòu)建多基因編輯載體[104,55]。由于Cpf1僅依靠crRNA即可完成基因組編輯且可獨(dú)立介導(dǎo)pre-crRNA的加工而無需其他分子的干預(yù)，RNA的加工能力又獨(dú)立于DNA剪切功能[49]。利用Cpf1的這一獨(dú)特功能，Zetsche等[55]設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR陣列，對(duì)HEK-293T細(xì)胞中的DNMT1、EMX1、VEGFA和GRIN2b等4個(gè)基因同時(shí)編輯，并對(duì)小鼠大腦中的DRD1、MECP2和NLGN33等3個(gè)基因同時(shí)編輯成功。1.5.4CRISPR/Cpf1的應(yīng)用CRISPR/Cas9已廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因治療等領(lǐng)域，而Cpf1系統(tǒng)具有多個(gè)編輯特點(diǎn)，因而有望成為與Cas9特性互補(bǔ)的一種新基因編輯工具。Kim等[105]使用AsCpf1和LbCpf1以RNP的形式編輯大豆FAD2基因和煙草AOC基因。Cpf1產(chǎn)生更多的基因功能缺陷類型，且顯示出更精確的靶向特異性，也就是說，在每個(gè)可能的脫靶位點(diǎn)都沒有發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象；同時(shí)還利用LbCpf1/AsCpf1在煙草葉片原生質(zhì)體對(duì)煙草茉莉酸酯合成酶基因ALLENOXIDECYCLASE(AOC)編輯成功。Yin等使用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)研究控制水稻葉片氣孔密度的OsEPFL9基因，以O(shè)sEPFL9第一個(gè)外顯子作為基因編輯的靶標(biāo)位點(diǎn)，結(jié)果表明，基因編輯陽性水稻植株的遠(yuǎn)端表面的氣孔密度降低8倍以上[106]。Wang等在3個(gè)水稻基因中選擇6個(gè)位點(diǎn)，比較FnCpf1和LbCpf1的活性，發(fā)現(xiàn)Cpf1均可實(shí)現(xiàn)有效突變，且FnCpf1的活性低于LbCpf1[107]；同時(shí)，Wang等還設(shè)計(jì)由4個(gè)crRNA單元組成的crRNA矩陣序列，分別編輯OsRLK和OsBEL基因，每個(gè)位點(diǎn)的敲除效率在40%-75%之間。Hu等也利用Cpf1多基因編輯系統(tǒng)成功地編輯多個(gè)水稻基因[108]。Cpf1系統(tǒng)在水稻實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單有效的多基因編輯，擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)在植物中的應(yīng)用，并為水稻基因組編輯提供了新的工具。1.6研究的目的與意義限制性內(nèi)切酶通過特異性地識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列，而且只能識(shí)別一個(gè)特定位點(diǎn)；同時(shí)，限制性內(nèi)切酶只能剪切DNA，而不能同時(shí)對(duì)剪切后的DNA片斷重新連接。盡管基因編輯技術(shù)不斷發(fā)展，但仍存在一些不足。首先，目前應(yīng)用最廣泛的CRISPR/Cas9技術(shù)一般情況下只能執(zhí)行基因功能敲除，不能有效地使用同源重組和其他方法來取代基因片段和“敲入”基因功能。最后，盡管CRISPR/Cpf1的PAM與大多數(shù)CRISPR/Cas9不同之處在于它在5'端富含T序列，但對(duì)PAM序列相對(duì)固定的要求也限制了Cpf1在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)靶標(biāo)的選擇。而我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一種未曾報(bào)道過的DNA剪接新機(jī)制，即DNA片段在PCR擴(kuò)增過程中，可以將兩個(gè)相同的正向重復(fù)序列剪切后重新拼接在一起，形成新的較短的序列。本研究旨在統(tǒng)計(jì)分析這種新的剪接機(jī)制的結(jié)果，并作進(jìn)一步的驗(yàn)證。這種DNA自我剪接的機(jī)制將有可能應(yīng)用于基因編輯技術(shù)體系，在受體生物特定DNA中和供體DNA同時(shí)進(jìn)行定向剪接，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的“敲入”，從而有可能實(shí)現(xiàn)DNA片斷定向替換的基因編輯目的，為未來基因編輯技術(shù)提供新的思路和方向。1.7研究?jī)?nèi)容本實(shí)驗(yàn)選取不同大小的DNA分子片段，這些片斷均包含一段特定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)，這些DNA片斷在體外PCR擴(kuò)增過程會(huì)發(fā)生自我剪切（cleavage)和拼接(splice)。回收剪接后的產(chǎn)物，進(jìn)行二代高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)庫(cleandata)中進(jìn)行分析：首先在原始的DNA序列里查找到各種正向短重復(fù)序列的位置，設(shè)想兩兩序列之間進(jìn)行剪切再拼接，于是得到拼接后的序列，然后用這些預(yù)期拼接后的序列在cleandata中進(jìn)行比對(duì)與讀數(shù)的查找(blast)，記錄其剪接序列的讀數(shù)，對(duì)部分有讀數(shù)的剪接序列做進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。第二部分試驗(yàn)材料與方法2.1試驗(yàn)材料與試劑2.1.1植物材料水稻品種日本晴葉片。2.1.2質(zhì)粒包括NJZL(2.3kb)、F7869(1.0kb)、F2-28(2.1kb)等3個(gè)質(zhì)粒，均為帶有特定發(fā)夾結(jié)構(gòu)(大約500bp)DNA的T-載體質(zhì)粒。2.1.3試驗(yàn)試劑PCR擴(kuò)增MIX(南京諾唯贊)、膠回收試劑盒(天根)、瓊脂糖、TAE電泳緩沖液、LB培養(yǎng)基、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂、氨芐青霉素、T-載體連接試劑盒(生工)、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞(全式金)、CTAB、質(zhì)粒提取試劑盒(Megan)。2.1.4主要試驗(yàn)試劑的配制LB液體培養(yǎng)基(400ml)：胰蛋白胨(4g)、酵母提取物(2g)、氯化鈉(4g)；固體培養(yǎng)基再加入瓊脂(6g)。將以上成分混勻后，加入400ml的超存水，滅菌20min。氨芐青霉素：5g?Ampicillin置50ml塑料離心管中，加入40mlddH2O，充分混合溶解之后定容至50ml,?0.22μm濾膜過濾除菌，小份分裝(1ml/管)后，置于20℃保存。2%CTAB：CTAB(20g/L)、NaCl(81.82g/L)、0.5mol/LEDTA(pH=8.0，40mL/L)、1mol/LTris-HCl(pH=8.0，100mL/L)，用去離子水定容至1000mL。2.1.5試驗(yàn)儀器表1實(shí)驗(yàn)儀器信息Tab.1InformationofExperimentalInstrument儀器名稱來源HH-6數(shù)顯三用恒溫水箱科析儀器HC-2518高速離心機(jī)中科中佳D1008E高速離心機(jī)SCILOGEX移液槍GILSON培清JS-780全自動(dòng)凝膠成像分析儀培清超純水機(jī)Kertone超低溫冰箱Thermo超凈工作臺(tái)蘇凈安泰DYY-6C型電泳儀北京六一PCR擴(kuò)增反應(yīng)離心管BIOGI54DWS立式壓力蒸氣滅菌鍋ZEALWAYT-100PCR擴(kuò)增儀BIO金屬浴COYOTEWD-9403X藍(lán)光觀察儀北京六一智能恒溫培養(yǎng)振蕩器(HNY-2102C)天津歐諾電子天平(LQ-A1002)上?？破?.2試驗(yàn)方法2.2.1水稻葉片DNA的提取(CTAB)(1)取適量水稻葉片，12000rpm離心1min；(2)加700μl的CTAB在65℃水浴鍋加熱45min，后加700μl氯仿，12000rpm離心15min，吸上清；(3)2倍體積100%乙醇，-20℃冷凍30min，12000rpm離心15min，棄上清；(4)700μl的70%乙醇洗滌2次(每次12000rpm離心15min，且均棄上清)；(5)空離2min，吸出液體，65℃水浴鍋涼5min，加100μl純水溶解5min，振蕩搖勻，12000rpm離心30s，收集DNA。2.2.2構(gòu)建目的基因載體由金斯瑞生物科技有限公司合成并構(gòu)建分別含有3個(gè)不同長(zhǎng)度DNA片段的質(zhì)粒載體。每個(gè)DNA片段除了含有特定的發(fā)夾序列(500bp)外，且不同長(zhǎng)度的DNA片段也含有不同的組成結(jié)構(gòu)。2.2.3PCR擴(kuò)增體系(1)PCR擴(kuò)增采用25μl的PCR反應(yīng)體系：DNA模板1μl、5?primer1μl、3?primer1μl、VazymeGreenMix酶12.5μl和ddH2O9.5μl。PCR的反應(yīng)條件設(shè)置為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，退火溫度55-58℃退火30s，72℃延伸30s-150s，設(shè)置28-32個(gè)循環(huán)(溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)主要根據(jù)引物的長(zhǎng)度大小和酶的擴(kuò)增效率來確定)，72℃終延伸5min，12℃保存。(2)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物制膠體系：瓊脂糖2g、緩沖液100ml，配置好后晃動(dòng)錐形瓶混勻，放置在微波爐中加熱至全部溶解，取出待不燙手后加入核酸染料5μl，插入梳子等待凝固。瓊脂糖凝膠完全凝固后放入電泳池中，在膠孔第一個(gè)位置加入DNAladderMaker，其他位置按照順序每個(gè)孔5μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，120V、100mA，跑樣50min，電泳結(jié)束后在紫外成像儀下進(jìn)行觀察，通過DNAladderMaker大小鑒定是否為需要的DNA條帶，然后切出目的條帶割膠回收。2.2.4PCR產(chǎn)物割膠純化回收根據(jù)電泳結(jié)果割膠回收目的條帶，操作步驟如下：(1)割膠目的條帶，稱重加等體積PN溶液，50℃水浴(注意：如果直接純化，則按1：3比例加入PN溶液)；(2)500μl的BL溶液于CA2吸附柱中，12000rpm離心1min棄廢液；(3)將步驟(1)所得溶液室溫放置2min后加入CA2吸附柱中靜置2min后12000rpm離心1min棄廢液；(4)加600μl的PW漂洗液室溫靜置5min，12000rpm離心1min棄廢液，此步驟重復(fù)2次；(5)12000rpm空離2min，之后室溫靜置15min；(6)將吸附柱放在一個(gè)新的且干凈離心管中，加40μlddH2O，靜置2min,離心2min，得到回收產(chǎn)物，置于-20℃保存。2.2.5PCR回收產(chǎn)物T-載體連接回收產(chǎn)物連接T-載體體系：2×RapidLigationBuffer5μl、PGEM-TEasyVector1μl、PCRProduct3μl和T4DNALigase1μl，之后4℃連接過夜。2.2.6轉(zhuǎn)化回收產(chǎn)物4℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)化步驟如下：(1)從-80℃冰箱取出適量Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍；(2)解凍后取5μl連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞，輕混勻，冰浴30min；(3)冰浴后，42℃水浴鍋中熱擊30s，在冰浴2min；(4)加500μl的LB(不含Amp)液體培養(yǎng)，37℃、200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)1h；(5)吸80μl細(xì)胞懸液均勻涂在(含Amp)LB固體培養(yǎng)基上；37℃培養(yǎng)平板過夜。2.2.7陽性克隆鑒定(1)在含Amp抗性的LB固體平板上挑取單克隆菌落，將其接種于含500μlAmp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)5h左右；(2)取1μl菌液，用相對(duì)應(yīng)的引物配對(duì)進(jìn)行菌落PCR的鑒定。(3)PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，將獲得的陽性克隆單株測(cè)序。2.2.8質(zhì)粒提取(1)目的菌種接種培養(yǎng)過夜搖菌培養(yǎng)，1000rpm離心1min棄培養(yǎng)基；(2)250μlBufferP1，高速重懸細(xì)菌；(3)250μlBufferP2，顛倒混勻8-10次；(4)350μlBufferNP3,顛倒8-10次徹底中和，13000rpm離心1min；(5)上清液放入收集管中，13000rpm離心1min；(6)棄廢液，加500μlBufferPW1，13000rpm離心1min；(7)棄廢液，加600μlBufferPW2，13000rpm離心1min，重復(fù)操作該步驟；(8)棄廢液，13000rpm離心2min；(9)80μlElutionBuffer,靜置1min，13000rpm離心1min洗脫DNA，質(zhì)粒-20℃保存。2.2.9高通量測(cè)序把1F2R、NJZL、F7869和F2-28的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行高通量測(cè)序。其中1F2R和NJZL的高通量測(cè)序由武漢博越致和生物科技有限公司完成，而F7869和F2-28的高通量測(cè)序由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司完成。高通量測(cè)序前處理：包括片斷打斷處理和不打斷處理。加上通用接頭，均連接到通用測(cè)序載體上，進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)整理：對(duì)通過高通量測(cè)序得到大約6000000條測(cè)定的序列(rawdata)，剔除通用載體序列后得到cleandata數(shù)據(jù)庫。2.2.10正向重復(fù)序列(directrepeats)整理打開DNAStar中Editseq軟件，分別在DNA片斷1F2R(1.49kb)、NJZL(2.3kb)、F7869(1.0kb)、F2-28(2.1kb)原始序列中找到所有正向重復(fù)序列及其位置，用于分析那些預(yù)期的正向重復(fù)序列兩兩之間的剪切和拼接。2.2.11剪切和拼接結(jié)果的查找根據(jù)原始DNA序列里正向重復(fù)序列的數(shù)量和位置，設(shè)想兩兩之間剪切且拼接可形成一個(gè)新的較短的序列。將剪切拼接形成的序列在cleandate中進(jìn)行讀數(shù)的查找(blast)，分別統(tǒng)計(jì)四個(gè)DNA片段正向重復(fù)序列兩兩之間剪切拼接后形成新的較短的序列的讀數(shù)(reads)。2.2.12驗(yàn)證有讀數(shù)的剪接序列對(duì)部分讀數(shù)的剪接序列，在PrimerPremier5軟件中設(shè)計(jì)驗(yàn)證所需的特異引物，并合成設(shè)計(jì)的引物(生工生物有限公司)。用設(shè)計(jì)合成的特異引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)后回收目的條帶，將回收產(chǎn)物連接T-載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌、挑取單克隆，同時(shí)對(duì)挑取的單克隆菌株進(jìn)行菌液PCR的鑒定，將鑒定出的陽性單克隆菌株測(cè)序。2.2.13高通量測(cè)序中重組序列的驗(yàn)證特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)后，將目的條帶割膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行T-載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、挑取單克隆，并對(duì)挑取的單克隆菌株進(jìn)行菌液PCR的鑒定，鑒定出的陽性菌株測(cè)序。第三部分結(jié)果與分析3.11F2RDNA片斷PCR過程中剪接結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析3.1.1DNA片斷序列結(jié)構(gòu)1F2RDNA片斷全長(zhǎng)約1.49kb(圖2B)，其中包含1段長(zhǎng)約500bp特定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即可以產(chǎn)生反向互補(bǔ)的回文結(jié)構(gòu)(圖2A)。3.1.21F2RDNA片斷高通量測(cè)序引物序列：1F:5’AGTTGCTGAGGTTCGTTTGG3’2R:5’TGGAGGTTCTTGAGGCAGTT3’以水稻基因組DNA為模板，特異引物1F和2R配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果可以看出，有最亮的1.49kb條帶。同時(shí)，該條帶下面還有2個(gè)亮度清晰的條帶，分別是大小為1.226kb和0.264kb的條帶(圖2C)。我們將1.49kb條帶下面的1.226kb條帶回收，連接到T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑單克隆，用通用引物M13F和M13R對(duì)T載體質(zhì)粒測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在DNAStarMegalign軟件和Chromas峰形圖軟件中與原始序列進(jìn)行仔細(xì)的比對(duì)和分析，我們發(fā)現(xiàn)該1.226kb片斷是由于1.49kb片斷在兩對(duì)正向重復(fù)序列之間分別進(jìn)行剪切后再拼接形成的：一種是在1.49kb原始序列內(nèi)3個(gè)GCAGC位點(diǎn)中第1個(gè)和第3個(gè)之間進(jìn)行剪切再拼接(圖2D)；二是在1.49kb原始序列內(nèi)3個(gè)TGTAGCC位點(diǎn)中第1個(gè)和第2個(gè)之間進(jìn)行剪切再拼接(圖2E)。這兩種剪切方式中均會(huì)有一段0.264kb的中間片斷被切除下來(圖2D(c);2E(c))。這種特殊的DNA片斷體外剪切和拼接機(jī)制以前未曾報(bào)道過。同時(shí)，我們還觀察到，除了1.49kb、1.226kb和0.264kb這3條亮的PCR產(chǎn)物條帶外，電泳圖還有其他相對(duì)比較彌散的條帶。這些結(jié)果促使我們作進(jìn)一步的設(shè)想：在體外PCR擴(kuò)增過程中，1.49kb片斷中其他任意2個(gè)正向重復(fù)序列之間是否也會(huì)發(fā)生類似的剪切和拼接呢？也就是說，這種DNA片斷體外剪切后拼接的機(jī)制是否具有普遍性呢？為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，我們將1.49kb于DNA片斷作模板擴(kuò)增的所有PCR產(chǎn)物混合回收，進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)這個(gè)特殊的剪切和拼接機(jī)制進(jìn)行更深入的分析與驗(yàn)證。圖2PCR擴(kuò)增1F2R(1.49kb)DNA片段時(shí)在2對(duì)正向重復(fù)序列(GCAGC或TGTAGCC)位點(diǎn)處進(jìn)行自我剪切和拼接(A)500bp發(fā)夾結(jié)構(gòu)示意圖；(B)1F2R(1.49kb)DNA片斷序列結(jié)構(gòu)；(C)PCR擴(kuò)增1F2R(1.49kb)DNA片段的凝膠電泳以及可能由1F2R(1.49kb)DNA片段PCR擴(kuò)增過程中的自我剪切、拼接或缺失產(chǎn)生的較小DNA片段；(D)(a)由1F2R(1.49kb)DNA片段PCR擴(kuò)增過程中自我剪切和拼接產(chǎn)生的1F2R(1.49kb)(WT)和CSF1(1.226kb)DNA片段在Megalignment中的部分對(duì)比結(jié)果；剪切和拼接位點(diǎn)在1對(duì)正向重復(fù)的GCAGC上(第1和第3個(gè)位點(diǎn)，淺藍(lán)色下劃線)；(b)1.226kbDNA片段的部分色譜圖；(c)PCR擴(kuò)增1F2R(1.49kb)DNA片段的自我剪切和拼接機(jī)制的示意圖，自我剪切和拼接后僅有的正向重復(fù)序列GCAGC用淺藍(lán)色表示；(E)(a)1F2R(1.49kb)(WT)和CSF1(1.226kb)DNA片段在Megalignment中的部分對(duì)比結(jié)果；后者是由前者中1對(duì)正向重復(fù)序列TGTAGCC(第1和第2個(gè)位點(diǎn)，藍(lán)色下劃線)之間的自我剪切和拼接產(chǎn)生的；(b)1.226kbDNA片段的部分色譜圖；(c)PCR擴(kuò)增1F2R(1.49kb)DNA片段的自我剪切和拼接機(jī)制的示意圖，自我剪切和拼接后保留的正向重復(fù)序列TGTAGCC用藍(lán)色表示。在(D)和(E)中，相同顏色的下劃線表示相同的堿基序列。Fig.2Self-cleavage-and-spliceatpairofdirectrepeats,GCAGCorTGTAGCC,inthe1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification(A)Schematicdemonstrationofthe500bphairpin;(B)Structureof1F2R(1.49kb)DNAfragmentsequence;(C)AgarosegelelectrophoresisofPCR-amplified1F2R(1.49kb)DNAfragmentalongwithsmallerDNAfragmentsprobablyresultingfromself-cleavage-and-spliceordeletionduringPCRamplificationof1F2R(1.49kb)DNAfragment;(D)(a)PartialmegalignmentoftheDNAfragmentsof1F2R(1.49kb)(WT)andCSF1(1.226kb)resultingfromself-cleavage-and-spliceof1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification.Thecleavage-and-splicesiteisatthepairofdirectrepeatGCAGC(thefirstandthirdcopies,lightblue-underlined);(b)Partialchromatogramof1.226kbDNAfragment;(c)Schematicdemonstrationoftheself-cleavage-and-splicemechanismof1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification.TheonlydirectrepeatGCAGCremainingafterself-cleavage-and-splicewascoloredinlightblue;(E)(a)PartialmegalignmentoftheDNAfragmentsof1F2R(1.49kb)(WT)andthearound1.226kb(CSF2);thelaterresultedfromtheself-cleavage-and-spliceatpairofdirect-repeatTGTAGCC(thefirstandsecondcopies,blue-underlined),intheformer;(b)Partialchromatogramofthearound1.226kbDNAfragmentsasshowninB;(c)Schematicdemonstrationoftheself-cleavage-and-splicemechanismof1F2R(1.49kb)DNAfragmentduringPCRamplification.TheonlydirectrepeatTGTAGCCremainingafterself-cleavage-and-splicewascoloredinblue.In(C)and(D),thesame-coloredunderlinesannotatingbasesequencesrepresentedidenticalsequences.3.1.3正向重復(fù)序列(directrepeats)位點(diǎn)的整理在對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果的序列庫(readdatabase)進(jìn)行查找和比對(duì)之前，首先我們對(duì)1F2R(1.49kb)原始序列中所有的正向重復(fù)序列列出清單。表2列出1F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復(fù)序列的位置，其余的正向重復(fù)序列位置統(tǒng)計(jì)附表A。可以發(fā)現(xiàn)，在1F2R(1.49kb)序列中，有較多的正向重復(fù)序列，堿基數(shù)呈現(xiàn)出5-20bp不等。表21F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復(fù)序列位置Tab.2Partiallistofdirectrepeatsin1F2R(1.49kb)DNAfragment堿基數(shù)(bp)正向重復(fù)序列位置1位置2位置3位置4位置5位置6位置75GTAGG119412546GTTTTA2494244364607077AAAACTA1942262592903834148ATCTGTAG4845776406697007669ATTGGCTAT86087210AAATCTGTAG57563866776411ACAAAACTACA19222425728838112ATCTGTAGTTTT48457764066970013TGTAGTTTTGTGA48751955158061164367214CTGTAGTTTTGTGA48655057964267115TGTAGTTTTGTGATA58061167217TCACAAAACTACAGGTA19025518TTTATCACAAAACTACAG21825137519AATCTGTAGTTTTGTGATA48357666820TTAAATCTGTAGTTTTGTGA5736363.1.4兩個(gè)正向重復(fù)序列之間的剪接結(jié)果統(tǒng)計(jì)獲得高通量測(cè)序結(jié)果后，我們先設(shè)想1F2R(1.49kb)體外PCR擴(kuò)增過程中，如果兩個(gè)相同的正向重復(fù)序列剪切后重新拼接后形成新的較短序列，保留一個(gè)重復(fù)序列。然后我們利用這個(gè)假設(shè)產(chǎn)生的新序列在數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行比對(duì)，查找數(shù)據(jù)庫里面是否存在這樣對(duì)應(yīng)的序列讀數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大部分正向重復(fù)序列來說，數(shù)據(jù)庫中確實(shí)存在兩個(gè)正向重復(fù)序列之間剪切后再拼接形成的新的較短序列讀數(shù)。通過在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫中查找這些設(shè)想可能通過以上所描述的剪切拼接機(jī)制產(chǎn)生的剪接序列，我們發(fā)現(xiàn)，這些剪接序列存在與否的情況是：讀數(shù)(read)為0，表明可能相應(yīng)的兩個(gè)重復(fù)序列之間沒有發(fā)生剪接事件(event)；二是剪接序列有一定數(shù)量的讀數(shù)(reads)，表明相應(yīng)的兩個(gè)重復(fù)序列之間發(fā)生剪接事件。我們對(duì)部分有讀數(shù)的序列做進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。表3列出1F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復(fù)序列剪接的結(jié)果，剪接序列中所有的紅色和黑色標(biāo)記均指代不同的堿基序列，其中紅色標(biāo)記均為正向重復(fù)序列的本身，而兩邊的黑色標(biāo)記是各自的正向重復(fù)序列兩邊的序列。其余1F2R(1.49kb)片斷正向重復(fù)序列兩兩位點(diǎn)之間剪接結(jié)果的統(tǒng)計(jì)附表B。表31F2R(1.49kb)片斷中部分正向重復(fù)序列剪接結(jié)果的統(tǒng)計(jì)Tab.3Resultstatisticsofcleavage-and-spliceof1F2R(1.49kb)DNAfragmentbetweensomepairofofdirectrepeats正向重復(fù)序所在位置及個(gè)數(shù)剪接位點(diǎn)剪接序列讀數(shù)(reads)NJZL-1R1NJZL-1R2NJZL-2R1NJZL-2R2AGTGTCT3個(gè)(240-365-397)1-2GATTTAGTGTCTTCATT3032011-3GATTTAGTGTCTCCATT158342-3CATTTAGTGTCTCCATT333501ATTTAGTGT3個(gè)(236-329-361)1-2TACAGATTTAGTGTATTCG37001-3TACAGATTTAGTGTCTTCA3428012-3TATAGATTTAGTGTCTTCA13400AGAGA3個(gè)(742-744-1208)1-2AAGGAAGAGAAGAGC00001-3AAGGAAGAGAAATTA00002-3GGAAGAGAGAAATTA0000TTTATCACAAAACTACAG3個(gè)(218-251-375)1-2TACAATTTATCACAAAACTACAGGTACT43001-3TACAATTTATCACAAAACTACAGATTCA3027102-3TTCGTTTTATCACAAAACTACAGATTCA11604注：紅色標(biāo)注序列為剪接后保留的一個(gè)重復(fù)序列本身，紅色標(biāo)注序列兩端分別為剪接處兩個(gè)正向重復(fù)序列中前一個(gè)重復(fù)序列的前端序列和后一個(gè)重復(fù)序列的后端序列。3.1.51F2R內(nèi)正向重復(fù)序列GTAGG之間剪接驗(yàn)證的結(jié)果(1)設(shè)計(jì)引物的序列：ctcgatctcgtaggggaagtagaaggaagtagaagaggaaaggatgttgagatgaacattgggataagggtggtgaggcttagatcggaggcggtgatggagcttcgaccatgtggcgacactattgaaaagtattggacaagggtgtttgcgttggcgtggccatggaggtccagacaacggatgcttcacatcttggtgtggttgcgagtggcggcgatggacagggcaggcacaactgcctcaagaacctcca(2)引物序列：GTAGGF1:5?CTCGATCTCGTAGGGGAAGTAGAA3?GTAGGR1:5?GGAGGTTCTTGAGGCAGT3?GTAGGR2:5?TGTGAAGCATCCGTTGTC3?注：GTAGGF1為正向重復(fù)序列兩兩之間剪切拼接的序列前期的位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，原始序列里只有兩個(gè)GTAGG位點(diǎn)，分別是1194和1254。以水稻基因組DNA為模板擴(kuò)增1F2R(1.49kb)片斷的回收產(chǎn)物為模板，引物1F和2R配對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為驗(yàn)證GTAGG剪接序列的模板。引物GTAGGF1和GTAGGR1(目的條帶大小254bp)、GTAGGF1和GTAGGR2(目的條帶大小192bp)分別配對(duì)來驗(yàn)證這2個(gè)位點(diǎn)之間否真的存在剪切拼接的情況。凝膠電泳結(jié)果中，我們可以看到這兩種引物搭配都有擴(kuò)增條帶(圖3A)，且都與預(yù)期的目的條帶大小接近，這進(jìn)一步說明該重復(fù)序列之間有可能存在有和GCAGC(1-3位點(diǎn))和TGTAGCC(1-2位點(diǎn))相似的剪接情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)相似的剪接情況，我們把GTAGGF1+GTAGGR1搭配所擴(kuò)增出來的條帶割膠回收連接T-載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌、挑選20個(gè)單克隆。對(duì)挑取的單克隆用GTAGGF1+GTAGGR1引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，可以看到20個(gè)單克隆菌株中有16個(gè)菌珠DNA模板擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA條帶(圖3B)。挑取4個(gè)單克隆菌液PCR產(chǎn)物測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在DNAStarMegAlign軟件中與原始序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)所測(cè)序的4個(gè)PCR產(chǎn)物中有3個(gè)是在預(yù)期位置，即1194-1254之間剪接形成的(圖3C)。表明GTAGG的2個(gè)位點(diǎn)之間存在剪接機(jī)制。由于我們并不能確定這個(gè)新的剪接機(jī)制是否具有普遍性，且1或2個(gè)正向重復(fù)序列的剪接結(jié)果也不能說明這個(gè)新的剪接機(jī)制就一定具有普遍性，于是我們又繼續(xù)對(duì)1F2R(1.49kb)DNA片斷里的其他正向重復(fù)序列進(jìn)行了分析與驗(yàn)證。圖3正向重復(fù)序列GTAGG之間剪接驗(yàn)證(A)以1F2R(1.49kb)回收產(chǎn)物為模板并以引物1F+2R配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為DNA模板，引物GTAGGF1+GTAGGR1、GTAGGF1+GTAGGR2分別配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果；1-10：引物GTAGGF1+GTAGGR1配對(duì)；14-23：引物GTAGGF1+GTAGGR2配對(duì)；11和24：陰性對(duì)照；(B)以引物GTAGGF1+GTAGGR1配對(duì)PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物連接T-載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑取單克隆菌落為DNA模板，引物GTAGGF1+GTAGR1對(duì)單克隆進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果；1-20：引物GTAGGF1+GTAGGR1配對(duì)，21：陰性對(duì)照；(C)(B)中PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。M：DNAladderMarker。Fig.3Verificationofself-cleavage-and-splicebetweenpairofdirectrepeatGTAGG(A)AgrosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetofGTAGGF1+GTAGGR1andGTAGGF1+GTAGGR2,andrecovered1F2R(1.49kb)productastemplatewithprimersetof1F+2RPCRproductamplifiedasDNAtemplate;1-10:primersetofGTAGGF1+GTAGGR;14-23:primersetofGTAGGF1+GTAGGR2;11and24:negativecontrol;(B)AgrosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetofGTAGGF1+GTAGGR1,andmonoclonesofE.colitransformedwithT-vectorharbouringPCRproductofF1R1asDNAtemplate;1-20:primersetofGTAGGF1+GTAGGR1;21:negativecontrol;(C)SequencingresultsofPCRproductasmentionedin(B).M:DNAladderMarker.3.1.61F2R內(nèi)正向重復(fù)序列TGTGG之間剪接驗(yàn)證的結(jié)果(1)設(shè)計(jì)引物的序列：ttggcccgtgtggcgacacgacactattgaaaagtattggacaagggtgtttgcgttggcgtggccatggaggtccagacaacggatgcttcacatcttggtgtggttgcgagtggcggcgatggacagggcaggcacaactgcctcaagaacctcca(2)引物序列：TGTGGF1:5?TTGGCCCGTGTGGCGACA3?TGTGGR1:5?TGGAGGTTCTTGAGGCAGT3?TGTGGR2:5?TGTGCCTGCCCTGTCCAT3?注：TGTGGF1為正向重復(fù)序列兩兩之間剪切拼接的序列前期的位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在原始序列中有3個(gè)TGTGG位點(diǎn)，分別是25、1346和1434。本結(jié)果驗(yàn)證25-1346之間的剪接方式(位置)。以1F2R(1.49kb)片斷為模板，引物1F和2R配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物作為驗(yàn)證TGTGG剪接序列的DNA模板。然后用引物TGTGGF1和TGTGGR1(目的條帶大小157bp)、TGTGGF1和TGTGGR2(目的條帶大小138bp)分別配對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果表明，雖然兩種引物搭配都有條帶，但TGTGGF1與TGTGGR1引物搭配擴(kuò)增的條帶更接近預(yù)期的目的條帶大小位置(圖4A)。為了驗(yàn)證TGTGG的25和1346兩個(gè)位點(diǎn)之間剪接拼接形成的新的較短的序列是否存在，因此我們把引物TGTGGF1+TGTGGR1搭配所擴(kuò)增出來的條帶割膠回收，連接T-載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選20個(gè)單克隆。用這些單克隆菌液作DNA模板，引物TGTGGF1與TGTGGR1配對(duì)進(jìn)行菌液PCR鑒定，其中13個(gè)菌株DNA模板擴(kuò)增預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物(圖4B)。隨機(jī)挑取4個(gè)單克隆菌液PCR產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，所測(cè)序的4個(gè)PCR產(chǎn)物中有2個(gè)是在預(yù)期位置，即25-1346之間剪接形成的(圖4C)。說明在25和1346這兩個(gè)位點(diǎn)之間正向重復(fù)序列TGTGG具有剪接機(jī)制的存在。這進(jìn)一步說明剪接機(jī)制在1.49kbDNA片斷里可能具有普遍性，為了更進(jìn)一步的證明剪接機(jī)制在1.49kbDNA片斷里具有普遍性，針對(duì)1.49kbDNA片斷里的其他正向重復(fù)序列兩兩位點(diǎn)之間剪接形成的序列我們做了進(jìn)一步驗(yàn)證。圖4正向重復(fù)序列TGTGG之間剪接驗(yàn)證(A)以1F2R(1.49kb)片斷為模板并以引物1F+2R配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為DNA模板，引物TGTGGF1+TGTGGR1、TGTGGF1+TGTGGR2分別配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果；1-7：引物TGTGGF1+TGTGGR1配對(duì)；11-16：引物TGTGGF1+TGTGGR2配對(duì)；8和21：陰性對(duì)照；(B)引物TGTGGF1+TGTGGR1配對(duì)PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物連接T-載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑單克隆菌液為DNA模板，引物TGTGGF1+TGTGGR1進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果；1-20：引物TGTGGF1+TGTGGR1配對(duì)，21：陰性對(duì)照；(C)(B)中PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。M：DNAladderMarker。Fig.4Verificationofself-cleavage-and-splicebetweenpairofdirectrepeatTGTGG(A)AgarosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedusingprimersetofTGTGGF1+TGTGGR1andTGTGGF1+TGTGGR2,and1F2R(1.49kb)

fragmentastemplatewithprimersetof1F+2RPCRproductamplifiedasDNAtemplate;1-7:primersetofTGTGGF1+TGTGGR1;11-16:primersetofTGTGGF1+TGTGGR2;8and21:negativecontrol;(B)AgarosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetofTGTGGF1+TGTGGR1,andmonoclonesofE.colitransformedwithT-vectorharbouringPCRproductofF1R1asDNAtemplate;1-20:primersetofTGTGGF1+TGTGGR1;21:negativecontrol;(C)SequencingresultsofPCRproductasshownin(B).M:DNAladderMarker.3.1.71F2R內(nèi)正向重復(fù)序列GCAGC之間剪接驗(yàn)證的結(jié)果(1)設(shè)計(jì)引物序列：agagagaagagcagcacagaacagactccaagacctaacgtgtgtgtgattggtgggaccaggtattaatagtatagtaagcaactattgtatgaattggctattatattggctatagatgatttggagcttactattatagctagccaatctaatagtttattcatacaatagttacttataaacatatactacaccattaatatatggtcccgcctctcgtacacatataacgttttggagtctgtgctgcagctggctacaaatttgtagcctgctttgcttctctctcctcttttttctcttccacatgtgcttatagctgacttgtagcctgctattgtacctgctctaaacgagattcaataaaatgttactattaaataatgggcacttattaaatctttacgtagacctctactcgatctcgtaggagaaataaaagagaaattatattgtgaatctttgctgagacttttactcgatcttgtaggggaagtagaagaggaaaggatgttgagatgaacattgggataagggtggtgaggcttagatcggaggcggtgatggagcttcgaccatgtggcgacactattgaaaagtattggacaagggtgtttgcgttggcgtggccatggaggtccagacaacggatgcttcacatcttggtgtggttgcgagtggcggcgatggacagggcaggcacaactgcctcaagaacctcca(2)引物序列為：GCAGCF1:5?AGAGAGAAGAGCAGCACAGA3?GCAGCR1:5?GCACAGACTCCAAAACGT3?GCAGCR2:5?ATTTGTAGCCAGCTGCAG3?注：GCAGCF1為正向重復(fù)序列兩兩之間剪切拼接的序列前期正向重復(fù)序列位點(diǎn)整理結(jié)果表明原始序列里有3個(gè)GCAGC位點(diǎn)，即752、780和1016處，本結(jié)果驗(yàn)證752-780之間的剪接方式(位置)。以1F2R(1.49kb)片斷為模板，引物1F和2R配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物作為驗(yàn)證GCAGC剪接序列的模板。然后用引物GCAGCF1和GCAGCR1(目的條帶大小249bp)、GCAGCF1和GCAGCR2(目的條帶大小266bp)分別配對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。凝膠電泳表明，兩種引物搭配都有條帶，但引物GCAGCF1+GCAGCR1配對(duì)擴(kuò)增的條帶更符合預(yù)期的目的條帶(圖5A)。雖然通過PCR擴(kuò)增有所需的目的條帶，但是這不能說明在752和780這兩個(gè)位點(diǎn)之間就存在與752和1016這兩個(gè)位點(diǎn)之間相似的剪接機(jī)制，所以我們把GCAGCF1+GCAGCR1引物配對(duì)擴(kuò)增的條帶割膠回收進(jìn)行T-載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選20個(gè)單克隆。在以挑取的單克隆菌液為DNA模板，GCAGCF1+GCAGCR1引物配對(duì)進(jìn)行菌液PCR鑒定，有12個(gè)菌株作DNA模板擴(kuò)增有預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物條帶(圖5B)。隨機(jī)取4個(gè)單克隆菌液PCR產(chǎn)物測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，測(cè)序的4個(gè)PCR產(chǎn)物均是以預(yù)期剪接方式(位置)形成的，即752-780之間(圖5C)。測(cè)序結(jié)果同樣表明在752和780這兩個(gè)位點(diǎn)之間具有剪接機(jī)制的存在圖5正向重復(fù)序列GCAGC之間剪接驗(yàn)證(A)以1F2R(1.49kb)片斷為模板并以引物1F+2R配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為DNA模板，引物GCAGCF1+GCAGCR1、GCAGCF1+GCAGCR2分別配對(duì)PCR擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果；1-9：GCAGCF1+GCAGCR1配對(duì)；13-21：GCAGCF1+GCAGCR2配對(duì)；10和22：陰性對(duì)照；(B)引物GCAGCF1+GCAGCR1配對(duì)PCR擴(kuò)增的回收產(chǎn)物進(jìn)行T-載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取的單克隆的菌液DNA為模板，引物GCAGCF1+GCAGCR1配對(duì)對(duì)菌液PCR擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果；1-20：GCAGCF1+GCAGCR1；21：陰性對(duì)照；(C)(B)中PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果。M：DNAladderMarker。Fig.5Verificationofself-cleavage-and-splicebetweenpairofdirectrepeatGCAGC(A)AgarosegelelectrophoresisofPCRproductamplifiedbyusingprimersetsofGCAGCF1+GCAGCR1andGCAGCF1+GCAGCR2,and1F2R(1.49kb)

fragmentastemplatewithprimersetof1F+2RPCRproductamplifiedasDNAtemplate;1-9:primersetofGCAGCF1+GCAGCR1;13-21:primers