gcmssim法測定大白菜中嘧霉胺和乙霉威的殘留

gcmssim法測定大白菜中嘧霉胺和乙霉威的殘留

洋蔥是百合科的一種2年生蔬菜，是中國的重要出口量。近幾年來,隨著大蔥種植面積的不斷擴大和復(fù)種指數(shù)的提高,土壤病原菌逐年增多,大蔥病害的發(fā)生和危害程度也逐年加重。大蔥灰霉病是大蔥生產(chǎn)上的一種重要病害,一經(jīng)發(fā)病,危害嚴重,不僅影響蔥的產(chǎn)量和品質(zhì),嚴重時還可導(dǎo)致大蔥完全喪失食用價值。目前,用于防治灰霉病的藥劑主要有苯并咪唑類(包括多菌靈和甲基硫菌靈等)、二甲酰亞胺類(包括腐霉利和異菌脲等)、N-苯氨基甲酸酯類(主要為乙霉威)。有研究報道,灰霉病菌已經(jīng)對上述藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗性。因乙霉威與苯并咪唑類殺菌劑間具有負交互抗性現(xiàn)象,所以乙霉威仍是目前防治灰霉病菌的主要藥劑。嘧霉胺是20世紀末才投入使用的一種苯氨基嘧啶類新型內(nèi)吸性殺菌劑,其作用機理獨特,主要通過抑制病原菌蛋白酶的分泌而阻止病菌的侵染,具有葉片穿透和根部內(nèi)吸活性,對大蔥等作物的灰霉病有優(yōu)異防效。由于嘧霉胺和乙霉威的作用機制不同,混用或輪換使用這兩種藥劑將有利于延緩病菌抗藥性的發(fā)展,提高防治效果。國內(nèi)外對乙霉威、嘧霉胺在食品中的殘留檢測方法已有一些報道,但對其在大蔥中的殘留消解動態(tài)尚無報道。作者采用改進的氣相色譜-質(zhì)譜法研究了26%嘧霉·乙霉威可濕性粉劑在大蔥中的殘留消解動態(tài)以及最終殘留狀況,簡化了樣品的提取和凈化步驟,節(jié)省了溶劑和處理時間,提高了檢測的準確性和靈敏度。1藥劑、試驗方法和試驗過程試驗在山東省臨沂市河?xùn)|區(qū)太平大蔥基地進行。于2009年3月9日插蔥栽培,適時中耕、澆水、施肥。農(nóng)藥殘留消解動態(tài)與最終殘留試驗的第1次施藥時間均為2009年4月12日。藥劑為26%嘧霉·乙霉威[嘧霉胺(pyrimethanil)和乙霉威(diethofencarb)質(zhì)量比為10∶16]可濕性粉劑(青島瀚生生物科技股份有限公司),用衛(wèi)士WS-16型背負式手動噴霧器(噴頭內(nèi)徑為0.9mm)將藥劑噴施于大蔥表面。試驗期間4月份平均氣溫為15.1℃,光照時數(shù)230h,平均降水量為17.8mm;5月份平均氣溫為21.0℃,光照時數(shù)235h,平均降水量為108.5mm。1.1農(nóng)田測試方法1.1.1g/hm2試驗試驗為1次施藥,多次取樣。用26%嘧霉·乙霉威可濕性粉劑防治大蔥灰霉病的推薦劑量為1125~1800g/hm2(嘧霉胺有效成分180g/hm2,乙霉威有效成分288g/hm2),試驗時按照最高推薦劑量的2倍,即3600g/hm2(嘧霉胺有效成分360g/hm2,乙霉威有效成分576g/hm2)的劑量施藥1次,設(shè)3個重復(fù)小區(qū),同時設(shè)空白對照區(qū),共4個試驗小區(qū),每小區(qū)面積為30m2。采用背負式手動噴霧器均勻噴灑葉面。分別于施藥后1h和1,3,5,7,14,21,35d通過5點取樣后按四分法處理,切碎,混勻,立即于-18℃冰箱中保存待測。1.1.2重復(fù)施藥量、時間及區(qū)域隔期施藥劑量為推薦高劑量和加倍劑量,每個劑量設(shè)施藥2次和施藥3次2個處理,每個處理重復(fù)3次,加空白對照,共15個小區(qū)。施藥區(qū)整個植株均勻噴霧,施藥間隔期均為7d。分別于末次施藥后7,14,21d取大蔥樣品,取樣方法同消解動態(tài)試驗。1.2分析1.2.1標準工作液的配制7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司);KS型小型家用粉碎機;調(diào)速多用振蕩器(江蘇金壇金城儀器廠);SK8200H型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)儀器公司);MS3基本型旋渦混合器(德國IKA公司);RV05-ST型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國IKA公司);24位固相萃取裝置(AgelaTechnologies公司);KL512型氮吹儀(北京康林科技公司);GL-12B型高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。PSA/SAX固相萃取柱(容積6mL,填充物500mg/500mg,VARIAN公司);嘧霉胺和乙霉威標準品均購自德國Dr.EhrenstorferGabH公司,用正己烷-丙酮(7∶3,體積比)將其稀釋至500mg/L,儲存于-18℃冰箱中,臨用時再將其稀釋至適當(dāng)濃度,配制成混合標準工作液。氯化鈉為分析純,其余試劑為色譜純。1.2.2流出物的分離純化提取:準確稱取10.0g粉碎樣品于50mL具塞離心管中,加入20mL乙腈,振蕩提取30min,超聲提取15min。在離心管中加入7~8g氯化鈉、5mL蒸餾水,加蓋后劇烈振蕩1min,以5000r/min離心10min。吸取10mL乙腈相提取液于100mL雞心瓶內(nèi),35℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,加入2mL正己烷-丙酮(7∶3,體積比)溶解殘渣。凈化:用5mL正己烷-丙酮(7∶3,體積比)預(yù)洗PSA/SAX固相萃取柱,當(dāng)液面到達吸附劑頂部時,將上述溶液轉(zhuǎn)入萃取柱中。再每次用3.0mL正己烷-丙酮(7∶3)洗滌3次,將洗滌液移入萃取柱中。收集所有流出物于10mL具塞試管中,氮氣吹干。定量加入1mL正己烷-丙酮(7∶3,體積比),混勻,用于氣相色譜-質(zhì)譜測定。1.2.3電子擊穿源色譜柱為HP-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)毛細管柱,升溫程序為70℃保持1min,然后以25℃/min程序升至150℃,再以3℃/min升至200℃,最后以8℃/min升至280℃,保持5min。載氣為氦氣,純度≥99.999%,流速1.0mL/min;進樣口溫度250℃,脈沖不分流進樣,進樣量2μL;電子轟擊源電壓為70eV,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,GC-MS接口溫度280℃;選擇離子檢測(SIM),嘧霉胺和乙霉威分別選擇198,267作為定量離子,199,200和225,196作為定性離子。1.2.4定性和定量方法采用保留時間和離子豐度比定性,外標法、單離子峰面積定量,為減少基質(zhì)的影響,定量用標準溶液應(yīng)采用基質(zhì)標準工作液。1.2.5平均回收率和相對標準偏差準確添加嘧霉胺和乙霉威標準溶液于陰性大蔥中,分別設(shè)3個添加水平,每個水平設(shè)6個重復(fù),混合平衡30min后,按上述方法測定,求出平均回收率和相對標準偏差(RSD)。1.2.6檢測限和檢出限以符合檢測要求的最低添加濃度作為檢測方法的定量限。對定量限添加濃度的樣品提取凈化液進樣分析,使用工作站軟件以峰對峰方法(Pk-Pk)自動計算此濃度下的信噪比,以3倍信噪比估算檢出限。2結(jié)果與分析2.1洗脫溶劑的選擇以PSA/SAX柱為吸附劑,試驗了正己烷和含不同量丙酮的正己烷混合溶液的洗脫效果。結(jié)果表明,含體積分數(shù)為30%丙酮的正己烷混合溶液,能夠?qū)?0%以上嘧霉胺和乙霉威洗脫,且凈化效果最好,故選擇正己烷-丙酮(7∶3,體積比)作為洗脫劑。為優(yōu)化正己烷-丙酮(7∶3,體積比)的洗脫效率,分別在2.0,2.0,2.0,4.0,5.0和5.0mL收集洗脫液,對應(yīng)的洗脫液總體積2.0,4.0,6.0,10.0,15.0和20.0mL的洗脫曲線見圖1。可見,當(dāng)洗脫溶液體積為8.0~10.0mL時,嘧霉胺和乙霉威的回收率達到98%以上,故選擇洗脫液用量為10mL。2.2加標回收率與rsd在0.001~0.1mg/kg添加水平下,大蔥中嘧霉胺的平均添加回收率為97.8%~104.0%,RSD為2.7%~7.4%;在0.01~0.1mg/kg添加水平下,乙霉威的平均添加回收率為98.2%~107.2%,RSD為3.5%~4.8%(見表1),均在允許范圍內(nèi),符合農(nóng)藥殘留分析的要求。嘧霉胺、乙霉威氣相色譜-質(zhì)譜全掃描總離子流圖和選擇離子掃描流圖分別見圖2和圖3,嘧霉胺保留時間為16.66min,乙霉威保留時間為21.52min。2.3標準添加量的確定樣品中嘧霉胺和乙霉威的添加回收率和相對標準偏差均能滿足檢測要求的最低添加濃度,即方法的定量限分別為0.001和0.01mg/kg。經(jīng)在該添加水平下的信噪比估算,嘧霉胺和乙霉威的檢出限分別為0.0003和0.003mg/kg。2.4藥劑消解動態(tài)26%嘧霉·乙霉威可濕性粉劑施用于大蔥后,嘧霉胺的原始沉積量為2.648mg/kg,乙霉威的原始沉積量為3.402mg/kg(見表2和圖4),隨著時間的延長,嘧霉胺和乙霉威在大蔥中的殘留量逐漸降低,消解動態(tài)符合一級動力學(xué)方程ct=c0e-kt,式中:ct為施藥后間隔t時間的農(nóng)藥殘留量,c0為施藥后的原始沉積量,k為消解速率常數(shù),t為施藥后采樣間隔期。經(jīng)SPSS軟件統(tǒng)計,得到藥劑消解動態(tài)方程如下:①嘧霉胺消解動態(tài)方程:ct=2.0495e-0.1693t,r=0.9916;②乙霉威消解動態(tài)方程:ct=3.7043e-0.2259t,r=0.9809。根據(jù)消解動態(tài)方程可知,嘧霉胺在大蔥中的消解半衰期為4.1d,乙霉威的消解半衰期為3.1d。14d后嘧霉胺和乙霉威的消解率均達90%以上。2.5大鼠中的水霉胺和乙霉威的殘留情況在灰霉病發(fā)生季節(jié),將26%嘧霉·乙霉威可濕性粉劑按推薦高劑量1800g/hm2和2倍劑量3600g/hm2施藥,施藥次數(shù)最多3次,每次間隔7d,于末次施藥后7,14,21d采集大蔥測定嘧霉胺和乙霉威的殘留量,結(jié)果見表3。使用推薦高劑量施藥2~3次,大蔥中嘧霉胺的殘留量為0.007~0.348mg/kg,乙霉威的殘留量為ND~0.152mg/kg。其中21d后(大蔥收獲時)大蔥中嘧霉胺的殘留量為0.007~0.015mg/kg,乙霉威殘留量為ND。使用2倍劑量施藥2~3次,大蔥中嘧霉胺殘留量為0.024~0.560mg/kg,乙霉威殘留量為ND~0.394mg/kg。收獲時大蔥中嘧霉胺的殘留量為0.024~0.034mg/kg,乙霉威殘留量為ND~0.011mg/kg。3水噴霧中類農(nóng)藥殘留試驗本研究采用乙腈振蕩超聲提取,鹽析離心后,取部分上清液濃縮至干,以正己烷-丙酮溶解后,經(jīng)固相萃取柱凈化,用正己烷-丙酮(體積比7∶3)洗脫,濃縮定容后,用氣相色譜-質(zhì)譜檢測,方法簡便快速,靈敏度、準確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。26%嘧霉·乙霉威可濕性粉劑按2倍推薦高劑量3600g/hm2對水噴霧,在大蔥中的消解半衰期,嘧霉胺為4.1d,乙霉威為3.1d。14d后嘧霉胺和乙霉威均降解90%以上。表明嘧霉胺和乙霉威均屬于易降解農(nóng)藥(t1/2<30d)。徐浩等研究表明,嘧霉胺在黃瓜上的半衰期為5.11d,張玉亭等報道,嘧霉胺在葡萄葉片中的半衰期為3~4d,本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致。我國目前尚未制定嘧霉胺和乙霉威在大蔥中的最大允許殘留限量(MRL),日本規(guī)定嘧霉胺在大蔥中的MRL為2.0mg/kg,乙霉威為5.0