混料均勻設(shè)計法測定麻杏石甘湯中甘草酸的含量

混料均勻設(shè)計法測定麻杏石甘湯中甘草酸的含量

由于傳統(tǒng)中醫(yī)復(fù)合湯劑（傳統(tǒng)湯劑）的使用不方便，近年來，傳統(tǒng)的中藥湯劑開始用于臨床工作。傳統(tǒng)湯劑是按處方配藥,加水共煎而得;配方顆粒湯劑是將批量的單味中藥飲片分別加水煎煮、濃縮、干燥、分裝,使用時按處方混合,開水沖服即得。傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑的藥效學(xué)、臨床療效方面的比較已經(jīng)有了一些報道,但有關(guān)其化學(xué)組成方面的報道較少。麻杏石甘湯一方出自東漢名醫(yī)張仲景《傷寒論》一書,由麻黃6g,苦杏仁9g,甘草6g,石膏24g組方,該方具有辛涼宣肺,清熱平喘之功效,主治表邪未解,肺熱咳喘證。原方各藥用量為:麻黃四兩,杏仁五十個,甘草二兩(炙),石膏半斤。根據(jù)現(xiàn)代臨床經(jīng)驗(yàn)證明,石膏用量的大小在麻杏石甘湯治療咳喘癥的療效上起到了關(guān)鍵的作用,重用石膏能夠使該方的療效大大提高,使咳喘諸癥更快得到緩解。我們在研究麻杏石甘湯傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑中甘草酸含量時,發(fā)現(xiàn)兩種湯劑中甘草酸的含量有著極顯著的差異,麻杏石甘湯傳統(tǒng)湯劑中甘草酸含量為9.6322mg·g-1,麻杏石甘湯配方顆粒湯劑中甘草酸含量為7.3105mg·g-1。這一結(jié)果說明,傳統(tǒng)湯劑的混煎與配方顆粒湯劑的單煎的一些有效成分含量有著較大區(qū)別。為了研究麻杏石甘湯中每味藥材對甘草酸溶出的影響因素,我們采用了混料均勻設(shè)計法,對麻杏石甘湯進(jìn)行了拆方研究,對各提取液的甘草酸用HPLC進(jìn)行了含量測定,并對測定結(jié)果進(jìn)行了分析。此工作對闡明復(fù)方配伍原理有一定的意義。1藥品、制劑及固體制劑美國Agilent1100高效液相色譜儀,包括AgilentG1312A二元泵,G1315B二極管陣列檢測器,G1313自動進(jìn)樣器,G1316A柱溫箱,G1322A真空脫氣機(jī),Agilent-A.08.03化學(xué)工作站;超聲波清洗機(jī)(HS10260D,10L);800型離心沉淀器(25W,最高轉(zhuǎn)速4000r·min-1,上海手術(shù)器械廠)。藥材經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院董麗莎教授鑒定,麻黃(批號2005601)為麻黃科植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)的干燥草質(zhì)莖、甘草(批號2005601)為豆科植物甘草(GlycxycrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根莖、苦杏仁(批號2005601)為薔薇科植物杏(PrunusarmeniacaL.)的干燥成熟種子、石膏(批號20041010)為硫酸鹽類礦物硬石膏族石膏(GypsumFibrosuum.)。以上藥材均購于貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司。甘草酸單銨鹽(中國藥品生物制品鑒定所,批號:0731-9704)對照品;麻杏石甘湯中藥配方顆粒湯劑及其傳統(tǒng)復(fù)方湯劑(自制);甲醇為色譜純,醋酸胺、冰醋酸為分析純,水為重蒸餾水(自制)。2木材含量的測量2.1鹽酸麻黃堿添加量的測定照《中國藥典》2005年版一部麻黃含量測定項下進(jìn)行測定。本品按干燥品計算,含鹽酸麻黃堿不得少于1.0%。照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥD)測定。2.1.1流速7nm分析柱為DiamonislC18柱;以乙腈-0.1%磷酸(5∶95)為流動相;檢測波長為207nm;流速為1mL·min-1;柱溫25℃。《中國藥典》2005年版中,以乙腈-0.1%磷酸(11∶89)為流動相,其他色譜條件相同,但所得的峰分離效果不佳,經(jīng)調(diào)整流動相比例為(5∶95),得到的峰分離效果好。故保持其他條件不變,僅改變流動相比例作為該課題麻黃含量測定的色譜條件。2.1.2l量瓶的溶解精密稱取鹽酸麻黃堿對照品10mg,置100mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密量取2mL,置25mL量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL含鹽酸麻黃堿8μg)。2.1.3中性氧化合物ld50的制備取麻黃藥材細(xì)粉約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25mL,稱定重量,超聲處理(功率160W,頻率50kHz)45min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續(xù)濾液1mL,置中性氧化鋁柱(100~200目,1.5g,內(nèi)徑1cm)上,用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇洗脫,收集洗脫液約9mL,置10mL量瓶中,加入磷酸1滴,用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定。2.2甘草酸的測定照《中國藥典》2005年版一部甘草含量測定項下進(jìn)行測定。本品按干燥品計算,含甘草酸不得少于2.0%。照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥD)測定。2.2.1冰醋酸相、甲醇-1.2mol-1-酸沉內(nèi)萃取分析柱:DiamonislC18柱;流動相:甲醇-0.2mol·L-1醋酸胺溶液-冰醋酸(67∶33∶1);流速1mL·min-1;檢測波長為250nm;柱溫25℃。2.2.2單銨鹽對照品溶液取甘草酸單銨鹽對照品10mg,精密稱定,置50mL量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL甘草酸單銨鹽對照品0.2392mg,折合甘草酸為0.221mg)。2.2.3超聲處理法取甘草藥材中粉約0.3g,精密稱定,置50mL量瓶中,加流動相約45mL,超聲處理(功率250W,頻率20kHz)30min,取出,放冷,加流動相至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定。2.3苦杏仁苷質(zhì)量測定照《中國藥典》2005年版苦杏仁含量測定操作復(fù)雜,耗時較長。由于苦杏仁苷為指標(biāo)性成分,如此繁瑣的操作不利于也不適合于工業(yè)化生產(chǎn)中對苦杏仁苷質(zhì)量的控制。本實(shí)驗(yàn)選用現(xiàn)代化的檢測手法,對苦杏仁苷的含量進(jìn)行測定。照高效液相色譜法(《中國藥典》2005年版一部附錄ⅥD)測定。含苦杏仁苷不得少于3.0%。2.3.1流動相及檢測波長分析柱:DiamonislC18柱;流動相:甲醇-水(23∶77);流速1.5mL·min-1;檢測波長215nm;柱溫35℃。2.3.2對照溶液的制備精密稱取苦杏仁苷對照品,用甲醇溶解并制成0.1804g·L-1的苦杏仁苷對照品溶液。2.3.3粗粉液的制備取苦杏仁藥材,80℃干燥2h,打粉,過60目篩。精密稱取粗粉0.5g,置25mL量瓶中,精密吸取甲醇20.0mL,超聲30min,放冷,用甲醇定溶至刻度,搖勻,即得。分別精密吸取對照品與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測定。2.4嵌入甲基紅指示液照《中國藥典》2005年版石膏含量測定項下方法進(jìn)行含量測定,含含水硫酸鈣不得少于95.0%。取石膏細(xì)粉0.2g,精密稱定,置錐形瓶中,加稀鹽酸10mL,加熱使溶解,加水100mL與甲基紅指示液1滴,滴加氫氧化鉀至溶液顯淺黃色,再繼續(xù)多加5mL,加鈣黃綠素指示劑少量,用乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol·L-1)滴定,至溶液的黃綠色熒光消失,并顯橙色。每1mL乙二胺四醋酸二鈉滴定液(0.05mol·L-1)相當(dāng)于8.608mg的含水硫酸鈣。結(jié)果4味藥材指標(biāo)性成分的含量均符合《中國藥典》2005年版中規(guī)定。3方法和結(jié)果3.1檢測條件及檢測波長色譜柱:DiamonislC18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇-0.2mol·L-1醋酸胺溶液-冰醋酸(67∶33∶1);流速1mL·min-1;檢測波長為250nm(甘草酸單銨鹽在200~400nm掃描在250處有最大吸收);柱溫25℃。進(jìn)樣量為5μL,在上述條件下,甘草酸與雜質(zhì)峰可完全分離,空白樣品無干擾。3.2單銨鹽對照品溶液精密稱取甘草酸單銨鹽對照品11.28mg,置50mL量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL甘草酸單銨鹽對照品0.2256mg,折合甘草酸為0.221mg)。3.3對照品溶液的制備分別精密吸取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,用流動相稀釋配制質(zhì)量濃度分別為0.0442,0.0884,0.1326,0.1768,0.2210,0.2652g·L-1的甘草酸系列對照品溶液。精密吸取上述甘草酸系列對照品溶液各10μL,按“3.1”色譜條件依次測定,記錄色譜圖,以峰面積積分值(A)對進(jìn)樣量(ρ)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:A=710.033ρ+2.967,r=0.9999,甘草酸單銨鹽在0.442~2.652μg間濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。3.4密度實(shí)驗(yàn)研究精密吸取同一對照品溶液10μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,RSD=0.83%。3.5穩(wěn)定性研究精密吸取供試品溶液各10μL,照“3.1”色譜條件,每2h測定1次,各測5次,樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定。3.6加樣回收率試驗(yàn)稱取各味藥材9份,精密加入樣品含量的120%,100%,80%的甘草酸單銨鹽對照品,按“3.1”條件制備高、中、低濃度的供試液各3份,并按色譜條件項下進(jìn)樣,測定峰面積,記錄色譜圖,計算平均回收率分別為100.62%,97.17%,99.63%,RSD分別為2.74%,2.18%,2.89%。3.7中藥配比對麻杏石甘湯傳統(tǒng)復(fù)方湯劑制備工藝的影響為考察處方組合對甘草酸含量的影響,固定各組合中炙甘草的處方量為6g,對處方中其余3味藥材采用混料均勻設(shè)計的方法進(jìn)行設(shè)計中心配伍組合。按文獻(xiàn)選用混料均勻設(shè)計表Un(nS-1)來安排實(shí)驗(yàn),其中n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)和水平數(shù),s為待考察的因素數(shù),在此選表U9(93)。即對復(fù)方中3個因素各取9個不同水平并設(shè)計成9種不同配方進(jìn)行考察。具體算法如下:設(shè)Un(nS-1)為一個均勻設(shè)計表,其中第i行第j列的元素記為Uij;令Cij=(Uij-0.5)n,i=1,2,…,n,j=1,2…,n。則本列中各組分的配比為:Xi1=1-Ci112,Xi2=(1-Ck2)Ci112,Xi3=Ci2Ci112。i=1,2,…,n。X1,X2,X3分別為麻杏石甘湯處方中的3個成分,即麻黃、苦杏仁、石膏,每類中藥在方中配比(表1)的前列,組成了9個X1+X2+X3=1的,但配比不同的中藥組方。麻杏石甘湯整個處方總量為45.0g,由于炙甘草稱樣量為6.0g,則其余3味藥材的藥材量為39.0g。根據(jù)不同配比組方稱取藥材,按照麻杏石甘湯傳統(tǒng)復(fù)方湯劑的制備方法分別對9個組合進(jìn)行制備。具體組方配比見表1。即按照各組合的不同組方配比稱取藥材,加10倍量水常溫浸30min,煎煮保持微沸30min,趁熱過濾,濾渣加7倍量水煎煮保持微沸20min,趁熱濾過,合并2次濾液,藥渣水洗3次,與濾液合并,減壓濃縮,定容至50mL量瓶中,每一復(fù)方號同法平行制備3份,即得。3.8超聲處理法精密吸取各組方試液各2mL,置25mL量瓶中,加流動相約20mL,超聲處理(功率250W,頻率20kHz)20min,取出,放冷,加流動相定容至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液用0.45μm的微孔濾膜濾過,即得。3.9藥品配方的偏相關(guān)分析取各組供試液進(jìn)樣,在“3.1”色譜條件下進(jìn)行測定,測定不同組方配伍中甘草酸的含量,結(jié)果見表2。將數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行逐步回歸處理分析,得到回歸方程:Y=5.63460420+0.09793761339X1+0.03829447830X3。r=0.831931,Df=(2,6),F值=6.7437,顯著水平P=0.0292,對回歸方程的各項系數(shù)進(jìn)行偏相關(guān)分析,結(jié)果見表3。由回歸方程和表3可看出,X1(麻黃)對整個處方中甘草酸的含量有極顯著性影響,且為正相關(guān),即藥材麻黃在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的使用量越大,整個處方煎煮溶出的甘草酸含量也就越高;X3(石膏)對處方中甘草酸的含量也有一定影響,但影響并不顯著。4不同用量下麻杏石甘草酸含量的變化由回歸方程及偏相關(guān)檢驗(yàn)可知,麻杏石甘湯中麻黃用量對甘草酸含量有極顯著性影響。因此,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)選擇麻黃的最高用量23.0802g,最低用量1.0998g及中間用量15.4538g,分別與6g干草、9g苦杏仁、24g石膏組成3個復(fù)方,制備3個復(fù)方的供試液,每一復(fù)方平行制備3份,分別定容至50mL量瓶中。同上操作,分別注入液相色譜儀,測定,結(jié)果高、中、低麻黃用量配伍中甘草酸含量分別為14.1748,13.0147,11.6485mg·g-1(n=3)。將驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組成的3個復(fù)方的藥材量分別代入Y=5.63460420+0.09793761339X1+0.03829447830X3的回歸方程中,分別得到麻黃用量高、中、低3個不同用量條件下麻杏石甘湯中甘草酸含量的理論值(其中炙甘草、苦杏仁的稱樣量分別以6.000,9.000g計,石膏由于在方程中無顯著性影響,故其稱樣量以原處方量24.000g計),計算結(jié)果見表4。由表4可看出,隨著處方中麻黃用量越大,甘草酸的理論含量越大。從驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可看出甘草酸的含量隨著麻黃用量的增大,甘草酸的含量隨之增高。這與理論值的基本趨勢相同,即甘草酸的含量隨著麻黃用量的加大而增高。由于中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性以及多樣性,實(shí)際煎煮過程中甘草酸的含量與回歸方程得出的理論值在數(shù)值上有一定的差異,但其總體增高趨勢是相同的。因此,回歸方程Y=5.63460420+3.819566922X1+1.4934846537X3有意義,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)基本反映了復(fù)方中甘草酸含量與其他幾味藥的關(guān)系。通過回歸方程可看出麻黃對整個復(fù)方中甘草酸的含量有極顯著的、呈正相關(guān)的影響。5配方顆粒湯劑與