負(fù)吸光度法測(cè)定so

負(fù)吸光度法測(cè)定so

染料光度法，尤其是染料動(dòng)態(tài)光度法，具有高度的靈敏度、快速的分析速度和良好的選擇性。在過(guò)去的10年里，它引起了國(guó)內(nèi)外的快速發(fā)展。這是光度法的一個(gè)重要研究方向之一。但褪色法仍用基于生色法的原理、儀器和測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)定,存在三個(gè)方面的缺陷:(1)增加一個(gè)參比液,計(jì)算麻煩,操作難于規(guī)范,準(zhǔn)確度較差,阻礙了褪色動(dòng)力學(xué)光度法的推廣應(yīng)用。如堿性品紅和甲基綠褪色動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)亞硫酸鹽,均要求在三分鐘內(nèi)完成試劑參比液和樣液兩個(gè)溶液的移取有色劑、定容、搖勻、洗滌與裝液并測(cè)定。這不僅勞動(dòng)強(qiáng)度大,而且無(wú)法保證兩個(gè)溶液的操作相同。因此盡管方法靈敏度、快速等方面有著比目前衛(wèi)生防疫等部門廣泛應(yīng)用的鹽酸副玫瑰苯胺法及蒸餾法所不可比擬的優(yōu)點(diǎn),然而未見(jiàn)實(shí)際有人應(yīng)用;(2)信噪比小,準(zhǔn)確度差,不利于檢測(cè)下限的降低;(3)不能使用高吸光度試液,有色劑用量不能選擇在靈敏度最高、穩(wěn)定性最好的最佳范圍,從而遠(yuǎn)不能達(dá)到該褪色反應(yīng)應(yīng)有的靈敏度、準(zhǔn)確度及檢測(cè)上限與下限。據(jù)此作者提出了一種新的光度分析方法——負(fù)吸光度法,較好地解決了上述問(wèn)題,從而促進(jìn)了褪色光度法的研究與應(yīng)用。本文以堿性品紅(RA)褪色動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定SO2?332-為例,在前文基礎(chǔ)上探討負(fù)吸光度法用于褪色動(dòng)力學(xué)光度法測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)與原因。1實(shí)驗(yàn)部分1.1a貯備液PNA型分光光度計(jì),吸光度范圍為2.0~-1.0。1.0μg/mLSO2?332-標(biāo)準(zhǔn)溶液:162.5mg亞硫酸氫鈉(分析純),以0.1mol/LNaOH溶解并定容至100mL作貯備液(置冰箱內(nèi)可保存一周);SO2?332-工作液,用水稀釋其貯備液,現(xiàn)用現(xiàn)配;1×10-4、3×10-4mol/LRA溶液,由6×10-4mol/L堿性品紅(RA)水溶液稀釋而成;pH11.8緩沖液:0.1mol/L硼砂溶液以1.0mol/LNaOH溶液在pH計(jì)上調(diào)制;20mg/mLPO3?443-離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑:用適量K2HPO4溶于水;0.05mol/LH2SO4溶液。以上試劑純度不低于分析純,水為二次蒸餾水。1.2負(fù)吸光度法wso測(cè)定rao、ai1.2.1常規(guī)(正)吸光度法于兩支經(jīng)體積校正的11.7mL比色管中,一支加入定量(0.025、0.05、0.1……)SO2?332-(μg)的溶液,分別加入2.3mLPO3?443-溶液和緩沖液,1.7mL1×10-4mol/LRA溶液,立即計(jì)時(shí),用水定容至11.7mL,搖勻,移入1.0cm吸收池,以水為參比,于540nm處,在3min內(nèi)測(cè)定兩溶液的吸光度。試劑空白與褪色試液吸光度分別為Ao、Ai,計(jì)算:△A=Ao-Ai。1.2.2負(fù)吸光度法于數(shù)支經(jīng)體積校正的10mL比色管中,一支加入0.5mLH2SO4,以水定容至10mL,加入3×10-4mol/LRA溶液1.6mL,搖勻,作為固定參比液。其余比色管分別加入定量(0、0.025、0.05、0.1……)SO2?332-(μg)溶液、2.3mLPO3?443-溶液及緩沖液,以水定容至10mL。取一支移入3×10-4mol/LRA溶液1.7mL,立即計(jì)時(shí),振搖30s,移入1.0cm吸收池,540nm處,以固定參比液為參比,于3.00min讀取負(fù)吸光度值。2結(jié)果與討論2.1最佳條件選擇由表1間接摩爾吸光系數(shù)及回歸方程可知,負(fù)吸光度法測(cè)定SO32-的靈敏度較常規(guī)(正)吸光度法提高了40%。對(duì)于同一試液用兩種方法測(cè)定,靈敏度相同。有時(shí)略有差別,是儀器性能、操作及環(huán)境等的差異所致。其所以能提高靈敏度是該法能測(cè)定高吸光度試液,有色劑用量可選擇在靈敏度最高所需的最佳濃度。而用正吸光度法測(cè)定,受所測(cè)試液最大吸光度為0.7左右的限制(原因見(jiàn)2.3),有色劑用量遠(yuǎn)低于最佳濃度。按負(fù)吸光度法實(shí)驗(yàn)方法,在有色劑用量為用正吸光度法的2倍(試劑空白吸光度A為1.470)、3倍(A為2.184)及最佳濃度三種濃度下測(cè)定了SO2?332-,靈敏度分別提高36%、40%及44%。因現(xiàn)用儀器負(fù)吸光度范圍太窄,第三種濃度不能直接測(cè)定,有誤差,故表1選用第二種濃度。為便于比較,試驗(yàn)中,試液的其它條件與用正吸光度法的相同。如進(jìn)行最佳條件的選擇,靈敏度還可進(jìn)一步提高。對(duì)于催化褪色動(dòng)力學(xué)光度法,應(yīng)用負(fù)吸光度法測(cè)定,對(duì)靈敏度及線性范圍的影響,與非催化法相似但有差別,將另文討論。2.2有色劑用量測(cè)靈敏度表1中后法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為前法的16.6%及相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)表明,褪色光度法應(yīng)用負(fù)吸光度法測(cè)定,其準(zhǔn)確度優(yōu)于用正吸光度法。其原因是該法測(cè)定吸光度的信噪比遠(yuǎn)大于正吸光度法,且隨試劑空白吸光度的增大而增大(見(jiàn)表2),有色劑用量能選在靈敏度最高、穩(wěn)定性最好的最佳濃度以及操作簡(jiǎn)便、規(guī)范,減小了操作誤差。其中關(guān)鍵是提高了信噪比。2.3測(cè)下限的檢測(cè)表1中線性范圍數(shù)據(jù)表明,褪色光度法應(yīng)用負(fù)吸光度法測(cè)定遠(yuǎn)優(yōu)于用正吸光度法。上限提高了2倍。實(shí)驗(yàn)表明,在有色劑最佳濃度范圍內(nèi),線性范圍上限吸光度提高的倍數(shù)與試劑空白吸光度提高的倍數(shù)基本相同;上限吸光度值約為試劑空白吸光度的1/3;上限已足夠,再應(yīng)用以擴(kuò)展該限而操作計(jì)算麻煩的lgAo/Ai∝c的測(cè)定方法已無(wú)必要。能提高上限的原因是該法所用有色劑的濃度成倍增加,與它反應(yīng)的被測(cè)物相應(yīng)增加。表1數(shù)據(jù)表明,用負(fù)吸光度法測(cè)定能擴(kuò)展下限。反復(fù)測(cè)定了試劑空白、0.025、0.05及0.1μg四點(diǎn),用正吸光度法時(shí),0.1至0μg向下偏離線性。當(dāng)試劑空白吸光度大于用正吸光度法的2.5倍(表1中為3倍)時(shí),負(fù)吸光度法測(cè)定則無(wú)此偏離,表明能將下限擴(kuò)展到0。其原因與該法能提高準(zhǔn)確度相同。其中有色劑濃度增加,還能使被測(cè)物反應(yīng)更完全?，F(xiàn)以圖1及要求檢測(cè)下限吸光度為0.010為例,論述負(fù)吸光度法用于褪色法測(cè)定能提高信噪比這個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。設(shè)用正吸光度法測(cè)定時(shí),試劑空白吸光度為0.700(透光度T=19.95%,見(jiàn)圖1),樣液檢測(cè)下限的吸光度定是0.690(T=20.42%),據(jù)一般分光光度計(jì)標(biāo)尺滿量程為100μA及噪音為0.5μA,檢測(cè)下限信號(hào)電流i及信噪比D可按下式求出:i=(20.42-19.95)%×100μA=0.47μAD=0.47/0.5=0.94按上述方法,計(jì)算出正、負(fù)吸光度法測(cè)定檢測(cè)下限的信噪比列于表2。由表2可知,正吸光度法用于生色法,檢測(cè)下限的信噪比為4.50。而用于褪色法,其信噪比隨試劑空白吸光度的增加按指數(shù)規(guī)律下降。當(dāng)其吸光度為3時(shí),僅為0.0046。即使文獻(xiàn)上通常使用吸光度為0.7(左右)的試劑空白液,也只有0.94,與要求2~3相差甚遠(yuǎn)。信號(hào)被噪音淹沒(méi),無(wú)法檢出0.01的下限吸光度。要達(dá)到生色法同樣的信噪比(4.50),其下限吸光度須為0.048?？梢?jiàn)正吸光度法用于褪色法測(cè)定遠(yuǎn)不如用于生色法,且試液選用受最大吸光度0.7左右的限制。負(fù)吸光度法用于褪色法測(cè)定,無(wú)此限制,且檢測(cè)下限信噪比為4.66,優(yōu)于生色法的4.50,約為0.94的5倍,顯然能檢出0.010的下限吸光度,可使用最佳濃度有色劑的高吸光度試液。由圖1可知,提高信噪比的原因是該法移動(dòng)了測(cè)定下限吸光度的位置,按指數(shù)規(guī)律加大了信號(hào),而噪音不變。2.4