大孔吸附樹脂精制崗梅注射液工藝研究

大孔吸附樹脂精制崗梅注射液工藝研究

梅葉是冬青科植物的一種古老植物，屬于秋海棠。它有干燥的根系和根莖，苦味甘甜清新。具有清熱解毒、止咳、促進(jìn)吞咽、消除充血和緩解疼痛的功效。它可以用來治療感冒、咳嗽、發(fā)燒、津傷、咽喉疼痛、跌倒和疼痛等疾病。藥效學(xué)研究表明崗梅有抗流感病毒、抗炎、抗菌、抗腫瘤作用及抗心肌缺血等作用。主要有效成分為皂苷類,ilexosideXXIX是崗梅中含量較大的三萜皂苷類成分。大孔吸附樹脂在分離純化天然產(chǎn)物中有廣泛的應(yīng)用,AB-8型和D101型大孔吸附樹脂在分離皂苷類成分時具有較大的優(yōu)勢[8,9,10,11,12,13,14]。本試驗(yàn)以崗梅總皂苷結(jié)合ilexosideXXIX為指標(biāo)優(yōu)化崗梅藥液精制工藝參數(shù)。1梅葉青氨酸酯類,見204-n,5d-214SHIMADZU高效液相色譜儀(日本島津公司),SEDEX75蒸發(fā)光散射檢測器(法國SEDEX公司),N2000色譜工作站(浙江大學(xué)),AB204-N型萬分之一電子分析天平,十萬分之一電子分析天平(SartoriusCP225D)。崗梅采集于廣東省從化森林公園,經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波教授鑒定為梅葉冬青Ilexasprella(Hook.etArn.)Champ.exBenth的根及根莖。對照品ilexosideXXIX純度為98.9%(暨南大學(xué)天然藥物研究所張曉琦副教授提供)。乙腈、甲酸均為色譜純,水為超純水。2方法和結(jié)果2.1提取液的制備取崗梅藥材粗粉905g,加入8倍量的60%乙醇,加熱回流1.5h,濾過,濾渣再加入6倍量的60%乙醇,加熱回流1h,濾過,合并濾液,測定體積,得提取液11020mL,備用。2.2崗梅總糖含量測定2.2.1供試品溶液的制備量取崗梅藥液適量,蒸干,殘?jiān)?mL水溶解,上已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(13mm×150mm),用蒸餾水水洗至澄清,再用95%乙醇洗脫,收集醇洗液至100mL量瓶刻度,搖勻,即得供試品溶液。2.2.2崗梅總皂苷的測定在400～700nm波長處掃描,IlexosideXXIX與崗梅提取液的紫外吸收曲線基本一致,最大吸收波長為541nm,故采用ilexosideXXIX標(biāo)定崗梅總皂苷。IlexosideXXIX與崗梅提取液的紫外吸收曲線見圖1。2.2.3冰醋酸法精密吸取供試液0.5mL,置試管中,水浴蒸干,加5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL,搖勻,在60℃水浴中加熱20min,取出,冷水冷卻10min,加冰醋酸至5mL,搖勻,以相應(yīng)試劑作空白對照,541nm處測定吸光度。2.2.4總皂苷的測定精密稱取崗梅對照品ilexosideXXIX5.43mg,置5mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,得對照品溶液。精密吸取對照品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.14、0.18mL于試管中,照2.2.3項(xiàng)測定總皂苷的含量。以對照品質(zhì)量濃度C(mg/mL)對吸光度A進(jìn)行線性回歸,回歸方程為:A=28.383C-0.053,r2=0.9995,崗梅對照品溶液質(zhì)量濃度C在4.3～39.1μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。2.3一般肥皂測定的研究2.3.1儀器精密度試驗(yàn)精密吸取0.1mLilexosideXXIX對照品溶液于試管中,照2.2.3項(xiàng)測定,重復(fù)測定吸光度6次,計算結(jié)果得RSD為0.63%,表明儀器精密度良好。2.3.2重復(fù)實(shí)驗(yàn)精密量取崗梅供試液0.5mL各5份,照2.2.3項(xiàng)下方法測定總皂苷含量,結(jié)果得RSD為1.49%,表明方法重現(xiàn)性良好。2.3.3顯色后溫度的影響精密量取崗梅供試液0.5mL各6份,照2.2.3項(xiàng)顯色,顯色后室溫放置,分別在0、15min、30min、1h、2h、4h后測定吸收值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法經(jīng)過時間的延長,顯色效果不穩(wěn)定,顯色結(jié)束到測定吸收值的時間宜控制在30min內(nèi)。2.3.4加標(biāo)回收率和rsd精密量取崗梅供試液0.5mL各6份,分別精密加入對照品2.5mg,水浴蒸干,殘?jiān)尤?5%乙醇溶解并定容于50mL量瓶中,照2.2.3項(xiàng)測定,結(jié)果測得回收率為95.92%,RSD為2.14%。2.4ilexodisis吹口印數(shù)x2.4.1流動相的測定經(jīng)優(yōu)化色譜條件,確定以PhenomenexBDSC18柱(250mm×4.6mm,5μm)為固定相,以乙腈-0.2%甲酸為流動相,按表1梯度洗脫。漂移管溫度:40℃,載氣(氮?dú)?壓力:2.5bar,體積流量:1mL/min,柱溫:28℃,進(jìn)樣量:10μL。在以上色譜條件下測定,譜圖見圖2,3。2.4.2ilexosica—ilexosideXXIX標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別吸取對照品溶液1、2、4、10、25、30μL注入液相色譜儀,測定峰面積,以進(jìn)樣質(zhì)量的自然對數(shù)為橫坐標(biāo),峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為Y=1.3535X+4.7495,r=0.9998,表明ilexosideXXIX進(jìn)樣質(zhì)量在0.984～29.52μg范圍內(nèi)的自然對數(shù)值與峰面積的自然對數(shù)值成良好線性關(guān)系。2.5ilexol系統(tǒng)計算法的研究2.5.1加樣回收試驗(yàn)精密吸取對照品溶液10μL,在上述色譜條件下,重復(fù)注入液相色譜儀6次,測定峰面積,結(jié)果RSD為1.02%。表明儀器精密性良好。2.5.2iloposicaxix含量的測定精密量取崗梅藥液50.0mL各5份,分別水浴蒸干,殘?jiān)尤爰状既芙獠⒍ㄈ萦?0mL量瓶中,精密注入高效液相色譜儀各10μL,測定峰面積,計算ilexosideXXIX的平均含量,RSD為1.14%。表明方法重復(fù)性良好。2.5.3高效液相色譜法精密量取崗梅藥液50.0mL各6份,分別水浴蒸干,殘?jiān)尤爰状既芙獠⒍ㄈ萦?0mL量瓶中,精密注入高效液相色譜儀各10μL,分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣,測定峰面積,RSD為1.37%。結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定。2.5.4iloposica預(yù)測il提高回收率精密量取崗梅藥液10.0mL各6份,分別精密加入對照品5.0mg,水浴蒸干,殘?jiān)尤爰状既芙獠⒍ㄈ萦?5mL量瓶中,精密注入高效液相色譜儀各10μL,測定ilexosideXXIX含量,結(jié)果其平均回收率為99.91%,RSD為1.21%。2.6對精細(xì)工藝參數(shù)的研究和優(yōu)化2.6.1樹脂總皂苷及ilexosicammis含量測定及評估量取上述崗梅醇提取液61.0mL(相當(dāng)于生藥量5g)3份,水浴蒸干,分別加水溶解至25mL,上已預(yù)處理的AB-8、D101、F型大孔吸附樹脂柱(13mm×150mm),體積流量為1.0mL/min,收集過柱液;用100mL蒸餾水洗,收集水洗液,與過柱液合并;再用95%乙醇洗脫,收集醇洗液至100mL量瓶刻度。將醇洗脫后的樹脂先后用2%NaOH洗至澄清、蒸餾水洗至pH值為7,再用95%乙醇洗至澄清,置于烘箱中,烘干,稱定樹脂質(zhì)量。精密量取提取液、過柱及水洗液供試液、醇洗液供試液適量,分別按2.2.3項(xiàng)和2.4.1項(xiàng)下進(jìn)行測定并計算總皂苷和ilexosideXXIX的含量,根據(jù)比吸附量及解析率對3種樹脂進(jìn)行篩選。比吸附量:A=(M上-M水)/M樹脂;解析率:S=M洗脫/M吸附×100%。式中M上為上柱液中總皂苷或iIlexosideXXIX總含量(g),M水為過柱液、水洗液中總皂苷或iIlexosideXXIX總含量(g),M樹脂為樹脂質(zhì)量(g),M洗脫為醇洗液中總皂苷或iIlexosideXXIX總含量(g),M吸附為上柱液中總皂苷或iIlexosideXXIX總含量減去過柱水洗液中總皂苷或iIlexosideXX-IX總含量(g)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2,AB-8的比吸附量和解析率最高,F型樹脂的比吸附量與解析率均最小。綜合考慮比吸附量與解析率,AB-8大孔吸附樹脂適合用于崗梅總皂苷的精制。2.6.2動態(tài)吸附劑測定量取崗梅提取液243.5mL(相當(dāng)于生藥量20g),減壓回收至無醇味,加水稀釋至100mL即得上柱液,過已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(13mm×150mm),按順序收集過柱液,每2.5mL為1份,共收集34管。將34管過柱及水洗液再分別經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化,收集醇洗液,分別按2.2.3項(xiàng)和2.4.1項(xiàng)下進(jìn)行測定并計算總皂苷和iIlexosideXXIX的濃度。所得動態(tài)吸附曲線見圖4,第26管總皂苷質(zhì)量濃度為0.45mg/mL,已超過上柱液的5%。而第34管時iIlexosideXXIX未吸附率僅為3.91%,仍未超過上柱液的5%。說明以iIlexosideXXIX作為指標(biāo)考察樹脂泄漏點(diǎn)有一定的缺陷,不足以全面反映總皂苷的信息,總皂苷對最大上樣量的反應(yīng)更為敏感,故最大上樣量以總皂苷結(jié)果計。樹脂干質(zhì)量為4.04g,以5%即得泄漏點(diǎn)計,其最大上樣量為3.09g生藥/g干樹脂;以總皂苷計,其最大上樣量為119.43mg總皂苷/g干樹脂。2.6.3洗脫溶劑測定按照確定的最大上樣量,將崗梅上柱液過已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱,蒸餾水洗至澄清,再依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇分別洗脫4倍柱體積,收集醇洗液,分別按2.2.3項(xiàng)和2.4.1項(xiàng)下進(jìn)行測定并計算總皂苷和iIlexosideXXIX的含量。結(jié)果如表3顯示,60%乙醇可累積洗脫下幾乎100%的iIlexosideXXIX和約89%的皂苷,而80%乙醇可累積洗脫下約98.5%的皂苷,接近洗脫完全。綜合考慮工藝成本與洗脫效率,選擇80%乙醇為崗梅的大孔吸附樹脂精制工藝的洗脫溶媒。2.6.4洗脫溶劑用量的確定按照確定的最大上樣量及洗脫溶媒濃度,將崗梅上柱液過已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱,蒸餾水洗至澄清,用80%乙醇洗脫,每1倍柱體積分別收集,共收集6倍柱體積,備用。分別按2.2.3項(xiàng)和2.4.1項(xiàng)下進(jìn)行測定并計算總皂苷和iIlexosideXXIX的含量。結(jié)果見表4顯示,3倍柱體積的80%乙醇能將iIlexosideXXIX洗脫完全,也能洗脫97%的總皂苷,而更多洗脫溶媒僅能增加少量的總皂苷;綜合考慮總皂苷保留率和生產(chǎn)成本,確定洗脫溶媒用量為3倍柱體積。2.6.5皂苷和iiloposicaxx含量的測定根據(jù)樹脂精制工藝確定的參數(shù)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),取崗梅上柱液適量,平行2份,過已預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹脂柱(3.5cm×20.8cm),體積流量為1mL/min,收集過柱液,用蒸餾水洗,洗至澄清,收集水洗液,再用80%乙醇洗脫,收集3倍柱體積,備用。分別按2.2.3項(xiàng)和2.4.1項(xiàng)下進(jìn)行測定并計算總皂苷和iIlexosideXXIX的含量。結(jié)果見表5,6所示,經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂純化后,總皂苷和iIlexosideXXIX含量保留率均達(dá)80%以上,精制后固形物中總皂苷和iIlexosideXXIX分別達(dá)到87.03%及10.83%。3預(yù)處理?xiàng)l件的確定3.1本實(shí)驗(yàn)以崗梅藥材中特征性成分iIlexosideXXIX標(biāo)定崗梅總皂苷,以崗梅總皂苷和iIlexosideXXIX保留率為指標(biāo),篩選樹脂種類、最大上樣量、洗脫溶媒濃度和洗脫用量等大孔吸附樹脂精制工藝的關(guān)鍵參數(shù),并對精制前后HPLC特征圖譜進(jìn)行比較,結(jié)果更為可靠。本實(shí)驗(yàn)還篩選了藥液上柱前的預(yù)處理方式,包括離心工藝及上樣濃度對崗梅總皂苷和iIlexosideXXIX保留率的影響。結(jié)果顯示上柱液的離心工藝導(dǎo)致總皂苷損失較大,不宜采用;結(jié)合生產(chǎn)效率和工藝連續(xù)性,將上柱液濃度確定為0.2g生藥/mL。3.2經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究,確定崗梅藥液