細(xì)胞生物學(xué)研究方法

細(xì)胞由于體積小，一般需在顯微鏡下觀察，顯微鏡一般分為光學(xué)顯微鏡與電子顯微鏡。顯微鏡的放大倍數(shù)由目鏡與物鏡決定：放大倍數(shù)=物鏡×目鏡。清晰與否由分辨率（指能夠分辨出相鄰兩質(zhì)點間的最小距離，距離越小，分辨率越高）決定。一般來說，光鏡分辨率為0.2微米，電鏡分辨率為0.2納米。分辨率的限制因素為：入射光波長，介質(zhì)折射率，物鏡鏡口角。光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)為：光學(xué)顯微系統(tǒng)，光源，機(jī)械支撐系統(tǒng)，有些還有圖像采集系統(tǒng)。常見有三種：復(fù)式顯微鏡，相差顯微鏡以及熒光顯微鏡。復(fù)式顯微鏡分為單筒顯微鏡，雙筒顯微鏡。復(fù)式光學(xué)顯微鏡較為簡單，照明系統(tǒng)為可見光，光學(xué)系統(tǒng)為玻璃透鏡（目鏡，物鏡以及聚光鏡），另外還有機(jī)械與支架系統(tǒng)。普通復(fù)式顯微鏡的缺點：由于光的干涉，衍射現(xiàn)象，光線通過樣品時，兩個相鄰焦點的圖像可能發(fā)生重疊，進(jìn)而無法分辨，導(dǎo)致存在分辨極限。相差顯微鏡是指利用光線的干涉，衍射特征，時相位差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹?，增強樣品的明暗對比，從而觀察無色透明樣品的裝置。相差顯微鏡的特殊構(gòu)件為相差板，環(huán)狀光闌。相差顯微鏡的特點：樣品無需染色，可觀察活細(xì)胞及細(xì)胞器動態(tài)。熒光原理：熒光分子吸收入射光能量以后，電子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)電子不穩(wěn)定，會自發(fā)躍遷回基態(tài)，并輻射熒光。熒光顯微鏡原理：利用短波長電磁波為光源，激發(fā)樣品輻射熒光，之后利用樣品產(chǎn)生的自發(fā)熒光或誘發(fā)熒光，對細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定位研究的裝置。熒光顯微鏡的優(yōu)點：熒光顯微鏡主要用于定性，定位研究細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白質(zhì)，可以觀察活細(xì)胞。缺點：無法排除來自樣品焦平面以外的熒光，使得圖像的反差與分辨率降低。光學(xué)顯微鏡樣品的制備：固定，包埋，切片，染色固定：目的是殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞成分，以便進(jìn)一步處理和切片是不受破壞。固定的方法時將樣品浸泡于固定液中，是大分子交聯(lián)從而保持在一定位置，常用固定液有甲醛，戊二醛。包埋：目的是為切片做準(zhǔn)備，增強細(xì)胞的機(jī)械支撐力，方法是將樣品浸泡于介質(zhì)中，使介質(zhì)滲入整個樣品。常用介質(zhì)有石蠟，樹脂。切片：通過切片機(jī)將樣品切為適合于光學(xué)顯微鏡觀察薄片，約1~10納米。染色：由于細(xì)胞大部分組織都是無色透明的，因此需要通過染色給細(xì)胞不同的部分染上不同的顏色，以便于觀察，常用染色劑有蘇木精（堿性染料，可把染色質(zhì)核糖體染成藍(lán)紫色），伊紅（酸性染料，可把細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)染成紅色）等。電子顯微鏡有透射電子顯微鏡，掃描電子顯微鏡，探針掃描顯微鏡等。透射電子顯微鏡是指利用電子槍發(fā)出的高能電子束照射超薄樣品，透射電子經(jīng)電磁透鏡多下次放大后成像的裝置，其原理為樣品不同部分對電子束的散射程度不同，主要用于觀察樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡樣品的制備：超薄切片技術(shù)，冰凍蝕刻技術(shù)，負(fù)染色技術(shù)等。掃描電子顯微鏡是指利用高能電子束掃描樣品，激發(fā)樣品表面產(chǎn)生二次電子，進(jìn)而依據(jù)樣品不同部位產(chǎn)生二次電子數(shù)量的多少而成像的裝置，成像有立體感，主要用于觀察樣品的表面形貌。掃描電鏡的樣品制備：噴鍍技術(shù)，二氧化碳臨界點干燥法等。探針掃描顯微鏡：掃描隧道顯微鏡（STM），原子力顯微鏡（AFM）STM是指利用量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)所產(chǎn)生的隧道電流來掃描樣品表面形貌的裝置。AFM是指將探針安裝于懸臂上，通過探針針尖原子與樣品表面原子間弱相互作用力的變化，牽引懸臂移動，從而掃描樣品表面形貌的裝置?？茖W(xué)研究常常需要大量的細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)是指將生物組織或細(xì)胞從有機(jī)體內(nèi)取出，在體外模擬其生長條件，令其繼續(xù)生存并生長的技術(shù)。原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞，將所培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞。步驟：從機(jī)體中取樣，剪碎→用酶或EDTA等處理，將細(xì)胞連接處消化，使細(xì)胞分散→將所得細(xì)胞勻漿至于裝有配置好營養(yǎng)液的無菌瓶中培養(yǎng)，同時加入一定量小牛血清，以利于其生長和鐵臂→培養(yǎng)瓶中分散的細(xì)胞懸浮液很快貼壁生長，稱為貼壁細(xì)胞→細(xì)胞經(jīng)一定貼壁便迅速鋪展并有絲分裂，逐漸形成致密的細(xì)胞層，稱為單層細(xì)胞。傳代培養(yǎng)：原代細(xì)胞在適應(yīng)的體外培養(yǎng)條件下持續(xù)分裂的細(xì)胞。細(xì)胞系：原代細(xì)胞培養(yǎng)中，度過危機(jī)繼續(xù)生存下來，并保持二倍體及接觸抑制的傳代細(xì)胞。研究常用的細(xì)胞系有：小鼠成纖維細(xì)胞（3T3），人上皮細(xì)胞（HeLa），經(jīng)腺病毒轉(zhuǎn)化的人腎細(xì)胞（293），中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），人胚胎干細(xì)胞系（H1,HH9）。單克隆抗體是指將具有分泌特異性抗體能力的B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞既可分泌特異性抗體，又可無限增殖。由單個雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的克隆細(xì)胞群所分泌的高度純化針對一種抗原的特異性抗體。單克隆抗體的制備：在PEG或滅活病毒的誘導(dǎo)下，令免疫過的小鼠B淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（TK與HGPRT缺陷型）融合。融合細(xì)胞可能為B-B，瘤-瘤，瘤-B。將融合細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行篩選。單克隆抗體技術(shù)應(yīng)用廣泛，如檢驗醫(yī)學(xué)診斷試劑，蛋白質(zhì)提純，腫瘤的導(dǎo)向治療，放射免疫顯