基因表達(dá)的定量檢測分析報(bào)告

基

因

表

達(dá)

的

定

量

檢

測

分

析基因表達(dá)

的定量檢測方法1.蛋白表達(dá)水平的檢測：1)定量檢測分析：westernblotting、ELISA、HPLC2)蛋白質(zhì)功能分析：蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析：

免疫熒光技術(shù)蛋白相互作用研究：

酵母雙雜交、免疫共沉淀(

IP)、

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(

FRET

)酶活性檢測：

ELISA、HPLC2.mRNA

表達(dá)水平檢測：1

)

半

定

量RT-PCR2)

Northernblot3)

實(shí)

時(shí)

熒

光

定

量PCR(RealtimePCR)Northernblot

雜交是用來檢測真核生物RNA的表達(dá)量和大小，

以估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法，可以從大量的RNA樣本同時(shí)獲得這些信息。其基本步驟包括：1.完整mRNA的分離2.根據(jù)RN

A

的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對RNA進(jìn)行分離3.將RNA

轉(zhuǎn)移到固相支持物(尼龍膜)上，在轉(zhuǎn)移的過程中，要保持RNA

在凝膠中的相對分布4.將RNA固定到支持物上(UV

交聯(lián))5.

固

相RNA與

探

針

分

子

(DNA

或

RNA)雜

交6.除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針分子7.對特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測、捕獲和分析ta

Rn

VS

leCycle

NumberDeltaRn·實(shí)時(shí)熒光定量PCR

技術(shù)于1996

年由美國AppliedBiosystems公司推出，

由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PC

R從定性到定量的飛躍，而且

與

常

規(guī)PCR

相

比,

它具有特異性

更強(qiáng)、有效

解

決PCR污染問題

、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，

目前已得到廣泛應(yīng)用?！?/p>

實(shí)時(shí)熒光定

量PCR

原

理所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR

技術(shù)，是指在PCR

反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)檢測PCR

擴(kuò)增

反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，

通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲

線或內(nèi)參基因的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。·

與常規(guī)PCR技

術(shù)比

較：對PCR擴(kuò)

增反應(yīng)的終點(diǎn)

產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無法對起始模板準(zhǔn)確定

量，

無

法

對

擴(kuò)

增

反

應(yīng)

實(shí)時(shí)

檢

測

。Cycle

(

循

環(huán)

數(shù)

)一般而言，

熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。R

n

(

熒

光

強(qiáng)

度

)在熒光背景信號階段，

擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，

我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。

PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，

所以根據(jù)最終的

PCR

產(chǎn)物量不能計(jì)算出起

始DNA拷

貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，

PCR

產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，

在實(shí)時(shí)熒光定量

PCR

技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：

熒光閾值和

CT

值。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，

但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為

CT

值(threshold

value

)幾個(gè)常用名詞概念1.Ct

值的定義C代表Cycle,t代表threshold

(閾值，臨界值),

Ct

值的含義是：

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。Cycle

(

循

環(huán)

數(shù))Rn

(

熒

光

強(qiáng)

度

)2.熒光域值

(

threshold)

的設(shè)定PCR

反應(yīng)的前15

個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，

熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，

即：

threshold

=

10'SDcycle

3-153.Ct值

與

起

始

模

板的

關(guān)系研究表明，

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，

Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，

縱坐標(biāo)代表Ct

值。因此，只要獲得未知樣品的Ct

值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。Cycle

(

循

環(huán)

數(shù)

)前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號

(baseline)熒光閾值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍手動(dòng)設(shè)置：

大于熒光背景和陰性對照的熒光最高值；

進(jìn)入指數(shù)期的最初階段Rn

(

熒光

強(qiáng)

度

)絕對定量分析：Log模板起始濃度與Ct值呈線性關(guān)系Logof

DNAconcentrationCycle

number目的基因PCR目的基因目的基因克隆目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒提取，

OD值定量，

將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用質(zhì)

粒

標(biāo)

準(zhǔn)

品

的

制

備基

因

組DNA1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i)+9v稀釋緩沖液，

得標(biāo)準(zhǔn)品iilv標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，

得標(biāo)準(zhǔn)品v拷貝數(shù)的計(jì)算：待測樣本濃度(ng/ul)=OD26o×40×稀釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)×324待測樣本拷貝數(shù)(copies/ul)=待測樣本濃度/樣本分子量×6×1014倍比梯度稀釋方法：相對定量分析必須用內(nèi)對照基因(管家基

因)進(jìn)行校正，進(jìn)行相對表達(dá)量分析。β-Actin

GAPDHβ-2-microglobulin管家基因：

維持細(xì)胞基本代謝活動(dòng)所必須的基因，如GAPDH、Actin、HPRT等R

HPRT實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)值相

對

定

量

分

析雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對對照樣品、待測樣品的目的基因及管家

基因進(jìn)行定

量，

然

后

根

據(jù)

計(jì)

算

公

式

求

得

相

對

值

即

為

相

對表

達(dá)

量

。公式：

校正值=

果果結(jié)結(jié)量量定定因因基基家的管目待

測

樣

品

的

校

正

值對

照

樣

品

的

校

正

值2

-△△Ct法相

對

值

=2-△△Ct法：假設(shè)

目的基因和參照

基因擴(kuò)

增效

率

都

接

近10

0

%△Ct

(處理

前

)=

1

8

—

1

7

=

1

△Ct(處理后)=16-17.4=

—1.

4△△Ct=△Ct(處理

后)一

△

Ct(

處

理

前

)

=

—

1.4—1=—2.4比

率(處理后/處理前)=2-△△Ct=2-(-24)=5.3修

正

方

法：

如

果

我

們

知

道目

標(biāo)

基因

和

參

照

基因

有

相同的

擴(kuò)

增

效

率，

但

擴(kuò)

增

效

率

不

等

于

2

,

那

么2-△△ct可以修正為：E-△△Ct,

例

如

擴(kuò)

增

效

率

為

1

.

9

5

,

那

么

計(jì)

算

公

式

可

修

正

為

1

.

9

5

-

△

△ctJun(MeanCt)GAPDH(MeanCt)18161717.42-△△Ct法公

式

：Sample處理前處理后E1.951.95常

用

熒

光

標(biāo)

記

方

法非特異性熒光標(biāo)記SYBR

Green

I特

異

性

熒

光

標(biāo)

記TaqMan

ProbeProbeReporter

QuencherSYBR

Green

I染料法SYBR

Green

I是一種結(jié)合于所有dsDNA

雙螺旋小溝區(qū)域的具

有

綠

色

激發(fā)

波

長的

染

料

。SYBR

Green

ISYBR

Green

I染料法—

—作用機(jī)理熱

變

性

引物

F

F

F

F

熒光物質(zhì)F延伸反應(yīng)DNA

聚

合

酶

二引

物

退

火FAMTM,VIC?,

NEDTM,

CY5TM&

ROXTMAmplificationPlot

ReportDelta

Rnvs

Cycle1.0e+0001.0e-002Cycle

NumberCy5

FAMVICNED1.0e-001Delta

RnEmissionmaximum(nm)*513517518521538548552552553570582604607615640667707DyeFluoresceinOregon

GreenFAMSYBR

GreenTETJOEVIC@Yakima

YellowWHEXCy°3TAMRACy3.5ROXTexas

RedLightCycler-Red

640(LC640)Cy5Cy5.5Excitationmaximum(nm)490492494494521520538526535552560588587596625643683420

nm>460

nm500

nm540

nm580

nm620

nm660nmEMISSIONCy3Alexa568GFPFITCEXCITATIONDAPICy5Biosearch

BlueTM352

447BHO~-0495CR-430-520mmFAM

495

520TET

521

536CAL

FluorGold

540WIC/TETJDEREPLACENFNT)522

544J0E529555WIC

538

554534

nmBHQ-1

QR=480-580nmTe

579

nmBHQ

-2

OR-559-670

nmBHO-2

dye

is

recommendedfor

Puisar

650,Quasar

670.

and

auasar

705

dyes

dueto

slsc

guencngHEX

535

556CAL

Fluor

Orange

560(WICHECJDEBEPLACEMENT538

559Quasar570(CY3REPLACENENT)548

566CyTM

3

549

566NED546

575TAMRA

557

583CAL

Fluor

Red

590(TAMRAREPLACEMENT)569

591Cy3.5

581

596ROX

586

610CAL

Fluor

Red

610(TEXAS

REDRORFPLACFMENT)590

610Texas

Red

597

616CAL

Fluor

Red

635LC

RED

64個(gè)5REPLACENENT)618

637Pulsar

650

460

650Cy

5

646

669Quasar

670(CY5REPLACEMENT)647

670Cy

5.5

675

694Quasar

705(CYS.5REPLACEMENT]690

705BHU-3672

nmCA-620-730

nmDYE-5'-ToEX

EMFLUOROPHOREBHO

Dye*SYBR

Green

I與雙鏈DNA

進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如

果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或引物二聚體的產(chǎn)生，也將

同時(shí)被檢測，

從而可能導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。設(shè)計(jì)合適引物，

防止非特異性擴(kuò)增!融解曲線分析，單一峰

無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰

其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒

光，

因此定量不準(zhǔn)確

SYBRGreenI染料法優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格便宜，使用方便，

不用設(shè)計(jì)復(fù)雜的探針。缺點(diǎn)：無模板特異性，

對引物特異性要求比較高，不能進(jìn)行多重定量分析5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,R),

如FAM、VIC

等3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher,Q

)探針完整，R發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，

R與Q分開，發(fā)熒光Taq酶有5′→3’外切核酸酶活性，可水解探針

Taqman

探

針

法Taqman

探

針

法熱

變

性

引

物引

物和探針

與模

板

退火DNA聚

合

酶延

伸

反

應(yīng)G@2報(bào)告基團(tuán)淬滅基團(tuán)探

針探

針RRRMolecular

Beacon淬滅基因2.引物退火/探針雜交Polymerase3.延伸反應(yīng)2.引物退火/探針與模板的雜交Polymerase

B

探針雜交

@Taqman

ProbeMolecularBeacon探針淬滅基因背景熒光更低Primer11

1

」3.延伸反應(yīng)TTT熒光物質(zhì)1.熱變性1.熱變性熒光物質(zhì)Primer雜交TT反應(yīng)優(yōu)化反

應(yīng)

液

組

成

、

體

積■50ul

絕

對

不

必

要■20ul應(yīng)用廣，但成本高■推薦10ul,

但需要優(yōu)化引物與引物、

引物與探針濃度配比■

4×

4

組

合

，

5

0nm,300nm,600nm,900nm■

探

針

5

0nm,100nm,250nmqPCR一般使用二步PCR

擴(kuò)增，在退火-延伸整合步

驟結(jié)

束

時(shí)

進(jìn)

行

信

號

檢

測

。當(dāng)

PC

R反映效率低時(shí)可以使用三步

PCR擴(kuò)增

。

染料法可

以在72

℃延伸結(jié)束時(shí)檢測。探針法只

能在

退

火

結(jié)

束

時(shí)

檢

測

?？蓹z測的RNA

種類·含小分子RNA的Total

RNA

·小分子RNA(建議使用)RNA

抽

提

方

法·沉淀法抽提總RNA·

離心柱法富集小RNA更適合

一

次R

T

檢

測

特

異

的m

i

RNA

>

因

使

用

探

針

，

特

異

性

高>

相

對

來

講

靈

敏

度

低

于

染

料

法

檢

測適合

多

個(gè)

樣

本

中

檢

測

同

一

m

i

R

N

A>

M

G

B

或

L

N

A

探

針

價(jià)

格

較

高>

對

于

R

T

引

物

的

設(shè)

計(jì)

、

使

用

濃

度及

反

轉(zhuǎn)

錄

條

件

需

有

極

高

的

要

求>AB

I在L

o

o

p

反

轉(zhuǎn)

錄

法

上

開

發(fā)

的Mega

plex

TM

Primer

Pools彌補(bǔ)了其高通量的檢測的弱勢1

次

R

T

可

檢

測

所

有

m

i

R

N

A通

用

性育

無

背

是

泛

沈>

在

mat

u

r

e

-

m

i

R

N

A

低

表

達(dá)

的

情

況下，易被極高豐度的Pre

-

m

i

R

N

A

干

擾

檢

測

.>

更

適

合

mi

R

N

A

的

高

通

量

檢

測

>靈

敏

度

高，

但需

用

融

解曲

線來

進(jìn)

行

特

異

性

判

斷>經(jīng)

濟(jì)

、

方

便

3PolyA

polymerase

AAAAAAAAAA….Annealoligo-dTadaptorandRTreaction-AAAA

AAAAAAVTTTTTTT

T3'

TTTTTTTTTcDNA

templateready

for

qPCRaninOmo-minnaarEnpsinarTTTTTTTTTlmssselAmrmiRNA

RTprimer,1Step

1:StemIaop

RTIITII

IIimmcDNA

t

l-

i

PCRForward

primerR

imTerme:apeeTotal

RNAMaturemiRNA3'PolyadenylationReverse

transcription53cDNAqPCRAssayIaqManPoly

A加尾法Loop反轉(zhuǎn)錄法5*RcR

PC…pro

bemiENA!LISt

l

op

RT11

IIICDNAStep

2:ForwardPrimerTaqMano:eemiRNAmStep

1:

Ip

Step2:Real-timePGRForwardSybrgreen

l

ReverseRTlteIIm-1S>

檢

測

特

異

性

高

于

染

料

法，

但

靈

敏

度

偏

低需采

用

M

G

B

或

L

N

A

修

飾

探

針，成

本

偏

高>

探

針

的

錨

定

位

置

偏

R

T

引

物

部

分

，

設(shè)

計(jì)

簡

單>采用染料法，相對成本偏低.>檢測特異性高于PolyA加尾法，但

可能反轉(zhuǎn)錄的靈敏度低于PolyA加尾Loop反轉(zhuǎn)錄法探針檢測

Loop反轉(zhuǎn)錄法染料檢測Real-time

PCRRT

primerRp

sreprimerIIIIII1

11

HprobeRT1因素建議指標(biāo)效率5

個(gè)

數(shù)

量

級

梯

度

稀

釋Slope～-3.3R2>0.99精密度至少3個(gè)重復(fù)標(biāo)

準(zhǔn)

差

<

0

.

2

5(0.

5

或

者1

個(gè)

Ct

之內(nèi))靈敏度增

加

低

濃

度

樣

本的

重

復(fù)

數(shù)統(tǒng)計(jì)分析除了這些因素，還必須評估和驗(yàn)證合適的實(shí)驗(yàn)對照(如無模板對照，

無

反轉(zhuǎn)錄酶對照等)以及模板質(zhì)量。評價(jià)熒光

PCR

結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)>檢測熒光信號的步驟有誤：一般SG法采用72℃

延伸時(shí)采集，Taqman法則

一

般

在退火

結(jié)

束

時(shí)

或

延

伸

結(jié)

束

采

集

信

號

。>引物或

探

針降解

：

可

通

過

PAGE電泳

檢測

其完

整

性

。>

模

板

量不

足

：

對未

知濃

度的

樣品

應(yīng)

從系

列

稀

釋

樣本

的

最高

濃

度

做

起

。模板降解：

避

免

樣

品

制

備中雜

質(zhì)

的引

入

及

反復(fù)凍

融

的

情

況

。qPCR可能

出現(xiàn)

的

問

題

及

解

決

方

法1.

無

Ct值

出

現(xiàn)CyeleCyclega

lnes

aradde帆

擴(kuò)增效率低：反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。>

PCR

各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。PCR

產(chǎn)物太長：

一般采用80-150bp

的產(chǎn)物長度。2.

Ct

值出現(xiàn)過晚

(Ct>38)LogStartingQuantty,copy

number>

加樣存在誤差：

使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。>標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，

或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。>

引物或探針不佳：

重新設(shè)