放牧與圍草條件下針茅草原土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的變化

放牧與圍草條件下針茅草原土壤微生物生物量和群落結(jié)構(gòu)的變化

草地上的草地、大草地和克里茅是歐亞大陸草地草地群的一個帶性植物群落。它是內(nèi)蒙古草地的主要牧場，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用和非常重要的生態(tài)作用。由于受人為活動的干擾和長期不合理的利用,導(dǎo)致其生態(tài)脆弱,特別是在過度放牧等因素的綜合影響下,已呈現(xiàn)出嚴重的退化態(tài)勢。草地退化不僅是草原的退化,更重要的是草地土壤環(huán)境的退化。土壤微生物作為土壤的重要組成部分,受土壤環(huán)境和地上生物多樣性的影響,其生物多樣性,既代表著土壤的生物活性,也反映了土壤生態(tài)脅迫機制對其微生物群落的影響。并可用以較早地預(yù)測土壤有機質(zhì)乃至土壤環(huán)境的變化過程,是土壤質(zhì)量和土壤恢復(fù)性能評價的一項重要指標。近年來,有關(guān)放牧對草地土壤微生物多樣性影響的研究較多,主要集中于放牧對土壤微生物區(qū)系組成、遺傳多樣性、功能多樣性及土壤微生物的時空分布變化研究,且研究方法多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)、PCR-DGGE及Biolog法,但不能定量分析不同微生物類群的生物量信息。磷脂脂肪酸(phospholipidfattyacids,PLFAs)是活體微生物細胞膜恒定組分,對環(huán)境因素敏感、在生物體外迅速降解,因此特定菌群PLFA數(shù)量變化可反映出原位土壤真菌、細菌活體生物量與菌群結(jié)構(gòu)。利用磷脂脂肪酸法分析土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是一種快速、可靠并可重現(xiàn)的分析方法,可用于表征在數(shù)量上占優(yōu)勢的土壤微生物群落,近年來廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究中。而且放牧對土壤質(zhì)量造成的影響一直存在爭議,通過研究土壤微生物生物量來間接反映土壤質(zhì)量情況也是近年來研究的熱點之一。因此,研究放牧與圍欄條件下內(nèi)蒙古針茅草原土壤微生物生物量及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況,進一步揭示草原生態(tài)系統(tǒng)對人類干擾的響應(yīng)機制,為內(nèi)蒙古針茅草原的合理利用提供理論依據(jù)具有重要意義。1材料和方法1.1樣地的設(shè)置與放養(yǎng)研究地區(qū)內(nèi)蒙古呼倫貝爾草原地處N47°20′00″~50°50′30″,E115°31′00″~121°34′30″,位于內(nèi)蒙古高原東北部,海拔在650~750m之間,屬溫帶大陸季風氣候,年降水250~400mm,自東南向西北遞減,年均溫-3~1℃,年蒸發(fā)量為降水的2~7倍。光、熱、風能資源豐富,年均風速3.0~4.6m·s-1;無霜期80~120d,地帶性土壤為黑鈣土和栗鈣土。試驗設(shè)在地帶性植物群落貝加爾針茅草原、大針茅草原和克氏針茅草原的典型地段。分別選擇地勢平坦、開闊的區(qū)域,將圍欄草地及圍欄外自由放牧草地設(shè)置為監(jiān)測樣地。貝加爾針茅草原、大針茅草原和克氏針茅草原的圍欄樣地均于2001年6月設(shè)立的圍欄區(qū),每個圍欄樣地面積約380hm2,圍欄內(nèi)禁牧,圍欄外自由放牧,放牧家畜為呼倫貝爾肉用羊,貝加爾針茅草原放牧壓力為4.4只羊·hm-2、大針茅草原放牧壓力為2.9只羊·hm-2、克氏針茅草原放牧壓力為2.1只羊·hm-2,均屬中度利用。各樣地基本情況如表1所示,其中貝加爾針茅群落有植物58種,主要有貝加爾針茅、羊草(Leymuschinensis)、線葉菊(Filifoliumsibicum)、日蔭菅(Carexpediformis)等;大針茅群落有植物43種,主要有大針茅、羊草、冰草(Agropyroncristatum)、糙隱子草(Cleistogenessquarrosa)、洽草(Koeleriacristata)等;克氏針茅群落有植物38種,主要有克氏針茅、糙隱子草、冰草、草地麻花頭(Serraturakomarovii)、冷蒿(Artemisiafrigida)等。1.2土樣的采集與保存2009年7月中旬在植物生長旺季進行采樣。在每一個樣地內(nèi),沿等高線垂直方向設(shè)置三條樣線,每條樣線按照S型曲線選擇40個點,去除表面植被,用直徑為5cm的土鉆,取0~20cm土壤,最后將40份土樣混勻過篩,去除根系和土壤入侵物,采用“四分法”選取1kg土樣冷藏帶回實驗室保存于-70℃超低溫冰箱。1.3測量1.3.1土壤理化性質(zhì)測定土壤硝態(tài)氮采用紫外分光光度法,其他土壤基本理化性狀采用常規(guī)分析法測定。土壤有機質(zhì)、全氮、全磷分別采用重鉻酸鉀-外加熱法、半微量凱氏法和硫酸、高氯酸熔融-鉬銻抗比色法;土壤速效磷測定用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法;土壤銨態(tài)氮含量采用氯化鉀浸提-靛藍吸光光度法。測定結(jié)果見表2。1.3.2kso4提取法土壤微生物生物量碳、氮測定采用氯仿熏蒸0.5mol·L-1K2SO4提取法;采用MultiN/C3100TOC/TN(Jena,German)分析儀MultiN/C3100自動分析儀(Jena,German)測定提取液中的碳、氮。1.3.3型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀gc-ms分析脂肪酸的組成取相當于8.0g干土的新鮮土樣,利用Blight/Dyer法通過氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液振蕩提取總脂,經(jīng)硅膠柱層析分離得到磷脂脂肪酸,將得到的磷脂脂肪酸甲脂化,然后采用HP6890-HP5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析磷脂脂肪酸的組成,檢測中升溫程序如下:進樣后在50℃保持1min,之后以12℃·min-1的速率升到180℃,保持2min后以6℃·min-1的速率升到220℃,停留2min后以15℃·min-1的速率升到240℃,保持1min后以15℃·min-1的速率達到最終溫度260℃,并保持15min。氣相色譜與質(zhì)譜之間的連接溫度為280℃,用高純氦氣(1mL·min-1)作載氣。質(zhì)譜儀采用電子電離(EI)方式,電子能量為70eV。PLFA的定性根據(jù)質(zhì)譜標準圖譜和已有的相關(guān)報道,以正十九烷脂肪酸甲酯內(nèi)標物進行定量計算。1.4數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法本文試驗數(shù)據(jù)采用配對數(shù)據(jù)T檢驗法、主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)、相關(guān)分析等數(shù)學(xué)統(tǒng)計方法,分析軟件為MicrosoftExcel2003及SPSS16.0統(tǒng)計軟件。2結(jié)果與分析2.1不同放牧強度對土壤微生物生物量碳庫的影響內(nèi)蒙古針茅草原土壤微生物生物量碳的含量介于166.6~703.5mg·kg-1之間(表3),微生物生物量氮含量介于30.3~92.2mg·kg-1之間。中度放牧條件下,不同類型草地土壤微生物生物量碳、氮的變化不同,與圍欄樣地相比,貝加爾針茅草原土壤微生物生物量碳、氮分別降低了47.0%、22.8%;大針茅草原土壤微生物生物量碳、氮分別降低了25.6%、19.6%,而克氏針茅草原則微生物生物量碳無顯著變化,而且微生物生物量氮升高了13.9%。可能是由于土壤微生物以異養(yǎng)型種群為主,其生命活動過程需要消耗一定的能量,放牧擾動土層,降低地下生物量,相對來說可供微生物維持生命活動的能量不足,從而導(dǎo)致該貝加爾針茅草原、大針茅草原0~20cm土層中土壤微生物生物量C、N含量顯著降低。而克氏針茅草原地下生物量沒有顯著變化,所以微生物生物量C、N變化亦不顯著(數(shù)據(jù)未列出)。貝加爾針茅和大針茅草原放牧樣地土壤微生物生物量碳和土壤全碳含量均減少(土壤有機碳減少7.3%、15.8%,微生物生物量碳減少47.0%、22.8%),而微生物熵(SMB-C/SOC)比圍欄樣地分別下降42.8%、11.7%,由此得出土壤微生物生物量碳庫下降速率比土壤有機質(zhì)的下降速率快,導(dǎo)致貝加爾針茅和大針茅草原的微生物熵也隨之降低?？耸厢樏┎菰拍翗拥貏t比圍欄樣地升高了7.0%,產(chǎn)生這種差異的原因可能是克氏針茅草原放牧后土壤有機碳降低,而微生物生物量碳沒有顯著變化,所以放牧后微生物熵升高。2.2不同放牧干擾下,土壤微生物指標在放牧與圍欄條件下,內(nèi)蒙古針茅草原土壤中共檢測出28種PLFA生物標記磷脂脂肪酸(圖1)。分析表明針茅草原土壤中微生物群落PLFA種類、含量豐富,含有各種飽和的、不飽和的、分支的和環(huán)狀的磷脂脂肪酸生物標記。主要以直鏈飽和脂肪酸和支鏈飽和脂肪酸為主,相對含量占總量的2/3左右,其次是單烯脂肪酸。而不同樣地均檢測到雙烯脂肪酸18:2ω(6,9)t,相對含量均不到總量的5%。含量最高的脂肪酸為a15:0、16:0、i16:0,占脂肪酸總量的6%以上,15:0、16:1ω7c、i17:0、17:0、18:1ω9t、10Me18:0等脂肪酸含量也較高,超過2%,其余脂肪酸含量則多低于1.5%(表4,圖1)。研究表明,貝加爾針茅草原土壤微生物含量最豐富,圍欄樣地土壤的PLFA含量達到了27.27nmol·g-1,大針茅和克氏針茅草原依次降低。放牧干擾下,不同草原類型土壤微生物的PLFA種類發(fā)生改變,且土壤總的PLFA量均顯著降低。比較不同草原類型土壤微生物細菌和真菌的PLFA含量,主要真菌PLFA含量要低于細菌PLFA含量,而且圍欄內(nèi)外的土壤微生物細菌PLFA和真菌PLFA含量差異顯著。放牧樣地與圍欄樣地相比,貝加爾針茅草原分別降低了48.7%、72.7%,大針茅草原分別降低了26.8%、44.0%,克氏針茅草原則是細菌顯著降低21.3%,真菌無顯著變化(表5)。分析可知,不同類型草原放牧樣地和圍欄樣地土壤中革蘭氏陽性和陰性菌PLFA含量比(GP/GN)各不相同,各類型草原圍欄區(qū)土壤中革蘭氏陽性菌含量均高于革蘭氏陰性菌含量,而且放牧干擾下3種針茅草原土壤GP/GN比值均顯著下降。表明不同類型草原土壤微生物圍欄內(nèi)外差異顯著,放牧與圍欄相比,土壤中革蘭氏陽性細菌顯著降低。細菌與真菌的PLFA比值介于8.46~17.76之間,貝加爾針茅草原、大針茅草原均是放牧樣地顯著高于圍欄樣地,克氏針茅樣地則與之相反(如表5所示)。2.3不同利用方式對針茅草原土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響為進一步分析不同草原類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異,對放牧和圍欄條件下內(nèi)蒙古針茅草原土壤微生物磷脂脂肪酸結(jié)構(gòu)進行主成分分析(圖2)。結(jié)果表明,不同的處理在PC軸上出現(xiàn)了明顯的分布差異。第一主成分(PC1)對PLFA數(shù)據(jù)變異的貢獻率為63.8%,權(quán)重最大,第二主成分(PC2)對總PLFA數(shù)據(jù)變異的貢獻率是25.0%,累積貢獻率達到了88.8%。根據(jù)主成分因子得分矩陣可以將兩個主成分分別表示為ZPC1=0.355X1-0.097X2+0.422X3-0.135X4+0.361X5+0.044X6;ZPC2=-0.063X1+0.396X2-0.143X3+0.422X4-0.051X5+0.325X6。由此可以看出,PC1代表圍封,PC2代表放牧。不同的利用方式(放牧和圍欄)對針茅草原土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度是圍欄處理大于放牧處理。其中15:0、a15:0、i16:0等的第一、第二主成分得分均較高,主要代表細菌。第1(PC1)主成分正方向中,16:1ω7c、a17:0、18:1ω9t得分較高,它們代表圍欄樣地的優(yōu)勢類群;而16:0、16:1ω5t、17:0的第二主成分得分較高,說明16:0、16:1ω5t、17:0是放牧樣地的優(yōu)勢類群。2.4化菌plfa分析對氯仿熏蒸法測定的微生物生物量與PLFA測定結(jié)果進行比較,發(fā)現(xiàn)兩種方法測定結(jié)果在不同處理中變化規(guī)律較為相似,但也有不一致的地方:氯仿熏蒸法結(jié)果表明放牧干擾導(dǎo)致貝加爾針茅草原和大針茅草原土壤微生物生物量積累能力降低,而有利于克氏針茅草原土壤微生物生物量的保持。PLFA法分析表明,放牧導(dǎo)致各草原類型土壤PLFA量降低。研究還表明,脂肪酸標識的細菌、真菌、GP、GN及整體土壤微生物生物量與微生物生物量碳均呈極顯著相關(guān),說明PLFA分析方法和氯仿熏蒸法之間有很好的一致性,內(nèi)蒙古針茅草原可用微生物生物量碳估量細菌、真菌及整體土壤微生物生物量。通過對各菌群PLFA與土壤養(yǎng)分進行相關(guān)性分析表明(表4),土壤總PLFA量、細菌、真菌和GP的PLFA與土壤有機質(zhì)、全P均顯著正相關(guān),尤其是總PLFAs、細菌、革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的PLFAs與其相關(guān)水平更達到了極顯著程度(P<0.01),可用其來表征土壤這兩項重要的肥力屬性,也說明它們可用作評價土壤肥力與健康的生物指標,同時在這一地區(qū)土壤碳、磷含量也是影響土壤微生物數(shù)量和種類的最重要養(yǎng)分因素。相關(guān)分析結(jié)果還顯示,各菌群PLFA與銨態(tài)氮顯著正相關(guān)。3不同利用方式對內(nèi)蒙古針茅草原土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響微生物生物量表征著土壤的生物狀態(tài)、能量循環(huán)和土壤養(yǎng)分的生物有效性。在本研究中,不同類型草原因其地上部分生物量的差異使輸入到土壤中的有機碳含量明顯不同,草原的種類不同其枯落物的質(zhì)量也不同,以上兩個方面均會影響不同草原類型土壤微生物生物量碳、氮的活動。而放牧干擾下,牲畜踐踏破壞了土壤穩(wěn)定結(jié)構(gòu),使土壤微生物生物量降低。這是由于牲畜踐踏改變了土壤的緊實度,使土壤孔隙度和水穩(wěn)性團聚體減少,引起透水性、透氣性和水導(dǎo)率下降,土壤微環(huán)境改變,土壤微生物的繁殖代謝受到強烈的干擾,造成放牧樣地的微生物生物量顯著低于圍欄樣地(表3),而克氏針茅草原之所以圍欄內(nèi)外微生物生物量沒有顯著變化,可能是由于放牧樣地土壤的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮升高,土壤的礦化作用加強,0~20cm土壤微生物生物量在特定階段內(nèi)可以維持在原有水平或更高水平,這與以往很多研究達成共識。微生物群落直接而敏感地反映土壤生物活性和土壤環(huán)境的質(zhì)量變化。本研究表明,不同類型草原土壤微生物PLFAs差異顯著,圍欄區(qū)土壤的總PLFAs含量明顯高于放牧區(qū)。地上部分植物的生長情況不同會導(dǎo)致其根系分泌物和凋落物也不同,這些因素對土壤中微生物的生長和代謝有重要影響,從而影響土壤微生物數(shù)量和種類。Bardgeett等使用PLFA技術(shù)對不同放牧管理程度的草原土壤以及不同草原類型土壤微生物群落結(jié)構(gòu)開展研究,結(jié)果顯示放牧顯著降低了土壤微生物PLFAs生物量,這與本文的研究結(jié)果一致。草原土壤微生物受到多方面因素的影響,各因素的影響強度也不同。這是不同歷史原因、水熱梯度、土壤肥力、土壤環(huán)境狀況與土壤微生物協(xié)同發(fā)展的結(jié)果,健康良好的土壤環(huán)境促進土壤微生物的繁殖和生長,同時,土壤微生物又反過來會對土壤結(jié)構(gòu)進行改善,以及養(yǎng)分積累、轉(zhuǎn)化和維持起促進作用。細菌/真菌比可反映細菌和真菌相對含量的變化和兩個種群的相對豐富程度。此外,土壤細菌與真菌脂肪酸比值越低,土壤生態(tài)系統(tǒng)越持續(xù)穩(wěn)定。對于細菌與真菌的脂肪酸比值,貝加爾針茅草原和大針茅草原的圍欄處理明顯低于放牧處理。因此由本研究結(jié)果可以得出,對草地生態(tài)系統(tǒng)而言,圍欄處理的土壤環(huán)境穩(wěn)定性高于放牧處理,這主要是因為圍欄處理沒有牲畜的踐踏,保留了真菌菌絲體結(jié)構(gòu)完整性,使其生物量持續(xù)穩(wěn)定增長,從而降低了細菌與真菌的脂肪酸比值?？耸厢樏┎菰姆拍梁蛧鷻谔幚頉]有顯著差異,可能是由于克氏針茅草原放牧區(qū)含有比較高的速效養(yǎng)分,為土壤微生物提供了較為充足養(yǎng)分和能量物質(zhì)。研究還表明在草地自然生態(tài)系統(tǒng)中(圍欄),GP在細菌結(jié)構(gòu)中占優(yōu)勢,放牧干擾則降低了這種優(yōu)勢,圍欄外GPPLFA/GNPLFA比值顯著降低,可見放牧干擾引起細菌群落結(jié)構(gòu)明顯變化。而且雖然草原類型顯著影響了PLFA總量,但是并未引起微生物群落結(jié)構(gòu)明顯變化,通過對放牧和圍欄樣地的土壤磷脂脂肪酸結(jié)構(gòu)進行主成分分析(圖2)即可知,不同的利用方式(放牧和圍欄)對內(nèi)蒙古針茅草原土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,且圍欄處理的影響程度大于放牧處理。說明利用方式對于微生物群落的影響不僅在于微生物生物量的變化,也明顯影響微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤微生物群落組成